Regolazione epigenetica della Trombomodulina e del Tumor Necrosis Factor mediata da PARP-1 nel mesotelioma maligno

Cancer exerts a deep impact on haemostatic system, leading to a hypercoagulability state. Among solid tumors, asbestos-exposure associated cancer, malignant mesothelioma (MM), is one of the most complicated by thromboembolic episodes. Thrombosis pathogenesis is triggered by release of pro-coagulant and inflammatory factors, from cancer cells. Cytokines are involved in maintenance of hypercoagulability in cancer cells; Tumor Necrosis Factor (TNF-α) is the cytokine more involved in haemostatic system, down-regulating anti-coagulant activity; among its functions, TNF-α inhibits Thrombomodulin expression. Thrombomodulin (TM) is a natural anticoagulant and it is involved in various pathological processes including thrombosis, inflammation and cancer. Heterogeneous expression of TM was observed in cancers; low or no TM expression in cancer cells is associated with a poor prognosis. In this study, we analysed TM and TNF-α expression in biopsies of MM then compared with normal mesothelium tissues (NM). The involvement of DNA methylation in TM and TNF-α down regulation was investigated. To evaluate the role of PARP-1 in the epigenetic modifications, mesothelial cells (Met-5A) and MM cells (H28) are silenced for PARP-1 and the DNA methylation/acethylation-associated TM and TNF-α expression evaluated, by treatments with demethylating agent (5’-Aza-dC) and deacethylase inhibitor Trichostatin (TSA). A critical low TM and TNF-α expression at mRNA and protein level is found in MM biopsies and there is a significant relationship between hypermethylated status of their promoter CG island region and the loss of expression of both genes. Silenced TM observed in MM cells is restored by demethylating agent Aza-dC treatment and partially by deacethylase inhibitor Trichostatin TSA, while the epigenetic agents don’t affect the TM expression in Met-5A cells. Silenced TNF-α observed in MM cells is restored by both epigenetic agents Aza-dC and TSA, thus DNA methylation but also acethylation could be involved in silenced TNF-α. Silencing PARP-1 results in a marked downregulation of TM expression in Met-5A cells while restores TM levels in MM cells. Knockdown PARP-1 induces TM promoter methylation in Met-5A cells and demethylation in MM cells. Whereas, silencing PARP-1 results in a marked downregulation of TNF-α expression in both Met-5A and MM cells. Epigenetic regulation PARP-1-mediated is responsible for reduced TNF-α expression in MM cells, but also DNA acethylation has to be investigated.

Il cancro esercita un profondo impatto sul sistema emostatico dell’organismo, portando ad uno stato di ipercoagulabilità, che può condurre a complicanze trombotiche. Tra i tumori solidi, il mesotelioma maligno (tumore associato all’esposizione all’amianto) è tra quelli maggiormente interessati da complicanze trombotiche. La trombo-patogenesi è scatenata dal rilascio, da parte delle cellule tumorali, di fattori pro-coagulanti ed infiammatori, che contribuiscono al mantenimento dello stato di ipercoagulabilità. Il Tumor Necrosis Factor (TNF-α) è la citochina che più influisce sul sistema emostatico, mediante una down regolazione delle funzioni anti-coagulanti, quali l’inibizione della Trombomodulina (TM), un anti-coagulante naturale coinvolto in vari processi patologici, inclusi trombosi, infiammazione e cancro. Una ridotta o assente espressione di TM è associata con una prognosi drammatica del tumore. In questo studio, abbiamo analizzato l’espressione di TM e del TNF-α e abbiamo osservato una ridotta espressione di entrambi i geni in campioni di biopsie con mesotelioma maligno (MM) rispetto ai tessuti pleurici sani di controllo (NM). Successivamente, abbiamo indagato il ruolo dell’epigenetica nel silenziamento di questi due geni, con maggior attenzione sull’analisi dei profili di metilazione dei rispettivi promotori, che sono risultati entrambi ipermetilati nei campioni bioptici MM, ma non in quelli sani NM. Il coinvolgimento della metilazione nel silenziamento di TM e TNF-α è stato confermato anche in vitro: le linee cellulari mesoteliali immortalizzate (Met5A) e quelle di mesotelioma maligno (H28) sono state trattate con l’agente demetilante 5’-Aza deossicitidina (5’aza dC) e con l’inibitore delle deacetilasi Tricostatna (TSA). In seguito al trattamento con 5’aza dC, sia TM sia TNF-α erano drasticamente ripristinati nelle cellule H28 ma non nelle Met5A (dove i trattamenti non avevano alcun effetto). Solo per il TNF-α abbiamo osservato una significativa riespressione anche in seguito al trattamento combinato 5’aza dC + TSA nelle cellule H28, facendo ipotizzare un possibile coinvolgimento anche dell’acetilazione nel silenziamento del TNF-α. Infine, abbiamo analizzato il possibile ruolo della Poli(ADP)-ribosio polimerasi (PARP-1) come regolatore epigenetico di questi due geni, valutando gli effetti del suo silenziamento sull’espressione di TM e TNF-α nelle linee cellulari Met5A e H28. Nelle Met5A, il silenziamento di PARP-1 determinava una forte riduzione di TM e di TNF-α, corrispondente ad un profilo di ipermetilazione del loro promotore; al contrario, nelle H28, il silenziamento di PARP-1 determinava una significativa riespressione di TM e una forte riduzione di TNF-α, corrispondente ad un profilo di ipometilazione e di ipermetilazione, rispettivamente. Da questo studio è emerso un chiaro ruolo della metilazione nella regolazione dell’espressione di TM nel mesotelioma maligno e questo meccanismo sembrerebbe essere mediato da PARP-1, che esercita un effetto contrario sull’espressione di TM, nelle cellule di controllo rispetto a quelle tumorali. Più controverso è il meccanismo di regolazione epigenetica del TNF-α, in quanto la metilazione potrebbe non essere il solo meccanismo epigenetico coinvolto; si dovrebbe indagare anche il possibile ruolo dell’acetilazione e l’eventuale coinvolgimento di PARP-1 nell’espressione di questo gene, nel mesotelioma maligno.