Danio rerio as a model for interdisciplinary study of complex ecological issues

Moving from the study of molecular interactions at the lowest level of biological organization, the challenge of this thesis has been to generate experimental data that can be effectively integrated with the investigation of higher level features in the broader contexts of system biology and ecology. To pursue this aim we explored interdisciplinary research fields, to examine hierarchical aspects with increases levels of complexity using biochemical, molecular, in vitro and in vivo studies on zebrafish (Danio rerio). Firstly, we characterized, in our vertebrate model, a functional endocannabinoid system, a novel neutral lipid signaling cascade deeply involved in regulating body homeostasis at both the central and peripheral levels. As a result of molecular, enzymatic and knock-down experiments, we showed that zebrafish embryos express a functional repertoire of endocannabinoid ligands and their regulatory metabolic enzymes and receptors. Moreover, we provide evidence for the role of 2-AG, the most abundant endocannabinoid in the zebrafish embryo, in neuronal outgrowth and fasciculation within the central nervous system. In a second instance, we went on to evaluate the peripheral role of this system in regulating adipogenesis, the process by which zebrafish larvae gain the ability to store fat reserves after yolk depletion. Using a both mammalian preadipocyte cells and zebrafish larvae, we tested Bimatoprost, a synthetic analogue of the endocannabinoid AEA-derivative, PGF2EA, in several adipogenic assays. We demonstrated an anti-adipogenic effect of Bimatoprost in murine preadipocytes and in developing zebrafish larvae , thus revealing an evolutionarily conserved endogenous role for AEA-derived PGF2EA in regulating this process. Therefore, in this first part of the thesis project, we established an involvement of the endocannabinoid system in zebrafish development at both the central and peripheral districts. Thus we propose that the endocannabinoid system is a suitable biomarker for endocrine disruptors resulting from environmental pollution. in agreement with previous studies from our group. Accordingly, in the subsequent study presented here, the water pollutant bisphenol-A appeared to produce food intake effects and non-alcoholic fatty liver disease, at least in part via alterations of endocannabinoid levels in adult zebrafish. Lastly, we used a multi-disciplinary approach to obtain a different point of view of the even higher complexity issue of marine biological invasions. Based on in silico studies, we were able to predict the chemical basis through which the invasive pest Caulerpa racemosa leads to dyslipidemia in the edible fish Diplodus sargus feeding on this exotic seaweed in the Mediterranean. The predicted interaction between caulerpin, the main secondary metabolite of this macrophyte, with its molecular target was confirmed with a variety of in vitro assays. Finally, this evidence was corroborated also in zebrafish larvae, where caulerpin was able to reduce yolk lipid content. Therefore, zebrafish has proven to be an excellent model to validate ligand-target interactions, which can shed more light on the nature of the complex mechanisms of ecological interactions, extending its possible use in decoding the meaning of independent phenomena that simultaneously occur in an ecosystem.

Partendo dal più basso livello di organizzazione biologica, questa tesi si è posta l’obiettivo di generare dati sperimentali su interazioni molecolari che potessero essere efficacemente integrati nello studio di proprietà emergenti a livelli più elevati di organizzazione, e nei più ampi contesti dell’ecologia e della biologia dei sistemi. Per questo scopo abbiamo adottato un approccio di ricerca interdisciplinare, esaminando aspetti di complessità crescente, mediante metodi biochimici e molecolari ed attraverso esperimenti in vitro ed in vivo su zebrafish (Danio rerio). In primo luogo abbiamo appurato la presenza nel nostro modello animale di un sistema endocannabinoide funzionale, che consiste in un signalling lipidico coinvolto nella regolazione dell’omeostasi energetica a livello centrale e periferico. In seguito a validazioni molecolari, enzimatiche ed esperimenti di knock-down, abbiamo constatato la capacità di zebrafish di esprimere, sin dai primi stadi embrionali, un set completo di ligandi endogeni e recettori, con i loro rispettivi enzimi metabolici. Allo stesso tempo abbiamo fornito evidenze sul ruolo essenziale del 2-AG, l’endocannabinoide più abbondante durante lo sviluppo embrionale di zebrafish, all’interno del sistema nervoso centrale, durante la fascicolazione e crescita neuronale. Successivamente abbiamo valutato il ruolo di tale sistema nella regolazione dell’adipogenesi a livello periferico e, quindi, nei processi attraverso i quali le larve di zebrafish accumulano le riserve di grasso un volta che il vitello si esaurisce. Usando un metodo integrato con cellule adipose di mammiferi e larve di zebrafish, abbiamo testato il Bimatoprost, un derivato sintetico dell’endocannabinoide AEA, PGF2EA, in vari saggi lipogenici. Ciò ha permesso di dimostrare farmacologicamente l’effetto anti-adipogenico del Bimatoprost sia in preadipociti murini che nelle larve di zebrafish, suggerendo un ruolo evolutivamente conservato di tale composto nella regolazione dell’adipogenesi. Pertanto, la prima parte del progetto di tesi ha chiarito un coinvolgimento del sistema endocannabinoide durante lo sviluppo di zebrafish e nella regolazione dell’omeostasi energetica a livello centrale e periferico. Successivamente, in linea con nostri precedenti lavori, ci siamo spinti a candidare il sistema endocannabinoide come possibile biomarker per lo studio dell’inquinamento da distruttori endocrini. Così, in un successivo lavoro, si è osservato che il contaminante ambientale bisfenolo-A induce maggiore consumo di cibo e malattia da fegato grasso non alcolico negli adulti di zebrafish, attraverso un’alterazione, almeno in parte, dei livelli degli endocannabinoidi. Infine, abbiamo affrontato la complessa problematica legata alle invasioni biologiche marine attraverso un approccio multidisciplinare. Partendo da studi in silico, siamo stati in grado di predire le interazioni chimiche alla base della dislipidemia riscontrata nel pesce commestibile Mediterraneo Diplodus sargus per effetto di una dieta che include l’alga invasiva Caulerpa racemosa. Vari saggi in vitro hanno poi confermato l’interazione prevista in silico tra il composto caulerpin, il principale metabolita secondario contenuto dall’alga, ed il suo target molecolare. Infine, il dato è stato confermato su larve di zebrafish, dove caulerpin ha prodotto una riduzione del contenuto di vitello nelle larve in via di sviluppo. Il modello zebrafish si è quindi dimostrato un eccellente strumento per validare interazioni target-ligando e per chiarire la natura di alcuni dei complessi meccanismi che regolano le interazioni ecologiche. Inoltre, i risultati ottenuti indicano che il modello può essere efficacemente utilizzato per decifrare il significato di fenomeni indipendenti che si verificano simultaneamente in un dato ecosistema.