CARATTERIZZAZIONE METAGENOMICA di MICRORGANISMI E ORGANISMI DEL TERRENO PER UN LORO UTILIZZO COME AGENTI di LOTTA BIOLOGICA CONTRO NEMATODI FITOPARASSITI

The rhizosphere microflora plays an important role in plants defense, development and growth. Many studies also showed that soil nematodes are capable of influencing its composition. Soil bacteria in turn produce a variety of compounds (antibiotics, nutrients, exoenzymes and other signal molecules), able to induce further changes. The objective of this work was to study the biodiversity changes of the bacterial microflora from an organic farm soil, following the experimental introduction of juveniles of Meloidogyne incognita and a treatment with a nematicide (fenamiphos). Following a metagenomic approach, total RNA was extracted from 2 g soil samples, sequencing the hypervariable V4 region of the bacterial 16S rRNA with an Illumina MiSeq platform. Bioinformatic analyses of the sequences obtained were performed with Pandaseq and Qiime. A totale of 578 genera belonging to 359 families and 197 orders was found, defining 4878 OTUs from 91 classes and 29 phyla, otherwise represented in the samples analyzed. Not all sequences allowed identification at the same taxonomic level for all bacteria, due to the lack of informations on lower taxonomic levels in the reference database. Among the genera common to both treatments we observed: Candidatus Solibacter, Streptomyces, Rubrobacter, Nitrospira and Steroidobacter, with varying frequencies in each sample. The presence of M. incognita and the nematicidal treatment led to the introduction or de novo identification of bacteria belonging to further taxa, when compared to the control. The metagenomic analysis also showed a significant variation in the bacterial diversity in relation to treatments carried out on the same soil, confirming that biodiversity should not be considered as static and determined, but undergoes changes induced by environmental variables also acting on very small scales and volumes. From the analysis of the sequence data obtained and despite the common origin of the soil samples, the degree of biodiversity observed suggests a component linked to the initial, heterogeneous distribution of species. On this basis, the chemical treatment and the presence of M. incognita induced further biodiversity changes, reducing or increasing certain genera more than others. The analysis of biodiversity observed in both experiments also indicates that a significant portion, if not the majority, of the bacterial species is still poorly understood by the taxonomic point of view. This is shown by the presence of OTUs belonging to genera such as Pseudomonas and Bacillus for which it is not yet possible to assign a species. In parallel, the same conclusions can be derived from the presence of other taxa, for which it is not yet possible to define a certain classification. Bacillus species increased in samples with nematodes, possibly including potential biocontrol agents. The identification of novel antagonists involves not only economic but also environmental benefits, thanks to the reduction of chemicals impacts, ensuring safety for operators and consumers and increasing the sustainability of rhizosphere management.

La microflora della rizosfera riveste un ruolo fondamentale sia nella difesa che nello sviluppo e crescita delle piante. Molti studi hanno dimostrato inoltre che i nematodi sono in grado d’influenzarne la composizione. I batteri a loro volta producono una varietà di composti (antibiotici, nutrienti, esoenzimi e altre molecole segnale), in grado d’indurre ulteriori cambiamenti. L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare i cambiamenti nella biodiversità della microflora batterica di un terreno proveniente da un’azienda biologica, conseguenti all'introduzione sperimentale di larve di Meloidogyne incognita e al trattamento con un nematocida (fenamifos). Seguendo un approccio metagenomico, l'RNA totale è stato estratto da campioni di 2 g di terreno, sequenziando la regione ipervariabile V4 del 16S rRNA batterico con piattaforma Illumina MiSeq. Le analisi bioinformatiche delle sequenze ottenute sono state eseguite con Pandaseq e Qiime. Sono stati rinvenuti 578 generi afferenti a 359 famiglie e 197 ordini, che definiscono 4878 OTU in 91 classi e 29 phyla, diversamente rappresentate nei campioni analizzati. Non tutte le sequenze hanno permesso un’identificazione di pari livello tassonomico per tutti i batteri presenti, per via della mancanza d’informazioni relative ai livelli tassonomici inferiori nei database di riferimento. Tra i generi comuni a entrambi i trattamenti sono stati osservati: Candidatus Solibacter, Streptomyces, Rubrobacter, Nitrospira e Steroidobacter, con frequenze variabili in ciascun campione. La presenza di M. incognita e il relativo trattamento nematocida hanno comportato l'introduzione o identificazione ex novo di batteri appartenenti a ulteriori taxa rispetto al controllo. L'analisi metagenomica ha anche mostrato una significativa variazione nella diversità batterica in relazione ai trattamenti effettuati sullo stesso terreno, confermando che essa non sia da considerare un dato statico e definitivo, ma sia soggetta a cambiamenti indotti da variabili ambientali presenti anche su scale e volumi molto ridotti. Dall'analisi delle informazioni ottenute dal sequenziamento e nonostante la comune origine dei campioni di terreno, il grado di biodiversità osservato suggerisce una componente iniziale legata all’eterogenea distribuzione di specie all’origine. Su questa base, il trattamento chimico e la presenza di M. incognita hanno indotto ulteriori cambiamenti sulla biodiversità, sia riducendo che incrementando alcuni generi rispetto ad altri. L'analisi della biodiversità osservata in entrambi gli esperimenti indica inoltre che una parte significativa, se non maggioritaria, delle specie batteriche sequenziate è ancora poco conosciuta dal punto di vista tassonomico. Ciò è indicato dalla presenza di OTUs appartenenti a generi come Pseudomonas e Bacillus per le quali non è ancora possibile assegnare una specie. In parallelo, le stesse conclusioni possono essere dedotte dalla presenza di altri taxa, per i quali non è ancora possibile definire una classificazione certa. Le specie di Bacillus associate a nematodi sono risultate numerose, includendo possibilmente potenziali agenti di biocontrollo. L’identificazione di nuovi antagonisti comporta vantaggi non solo economici, ma anche ambientali, grazie alla riduzione dell’impatto dei trattamenti nematocidi, garantendo sicurezza per operatori e consumatori e incrementando la sostenibilità nella gestione della rizosfera.