Computational Approaches for the Rational Design of Novel Topoisomerase I Poisons as Potential Anticancer Drugs.

La Topoisomerasi I eucariotica (TopoI) è un enzima essenziale che modifica il grado di superavvolgimento del DNA mediante un processo di rottura e successiva ricongiunzione di uno dei due filamenti del DNA, regolandone lo stato topologico richiesto nei processi di replicazione e di trascrizione. Il rilassamento del DNA superavvolto indotto dalla TopoI avviene attraverso la rottura transitoria di un filamento per mezzo di una reazione di transesterificazione. Quest'ultima coinvolge l'attacco nucleo lo da parte del gruppo ossidrilico di un residuo di tirosina (Tyr723) del sito attivo dell'enzima ad un legame fosfodiesterico del DNA a livello del sito di taglio, con formazione di un complesso covalente 3'-fosfotirosina TopoI-DNA (noto anche come cleavable complex). La rotazione del filamento tagliato intorno a quello intatto rende possibile il rilassamento della molecola di DNA. Il complesso binario covalente subisce in seguito un attacco nucleofilo a livello della fosfotirosina da parte dell'estremità libera 5'-OH del lamento rotto, che permette la riformazione del legame fosfodiesterico. La TopoI è il target specifico dell'alcaloide pentaciclico Camptotecina (CPT), isolato per la prima volta nel 1966 dalla corteccia di Camptotheca Acuminata, e dei suoi derivati, noti come veleni di TopoI. Queste molecole bloccano il processo di ricongiunzione del filamento di DNA tagliato, convertendo la TopoI in un agente dannoso per il DNA stesso. Queste molecole si intercalano tra le basi del DNA a livello del sito di taglio dando luogo alla formazione di un complesso ternario con la TopoI e il DNA. La maggiore stabilità del complesso ternario rispetto al complesso binario TopoI-DNA risulta in un aumento del tempo di vita del DNA tagliato. Poiché la presenza del veleno induce il disallineamento dell'estremità libera 5'-OH del filamento rotto con il legame fosfotirosinico, il processo di ricongiunzione non può avvenire. Questo porta all'attivazione di una serie complessa di segnali intracellulari, il cui risultato ultimo è la morte della cellula per apoptosi. Di conseguenza, le molecole in grado di formare complessi ternari stabili hanno attività antitumorale. L'utilizzo clinico della CPT è ostacolato sia dalla sua scarsissima idrosolubilità, sia perchè la sua forma attiva lattonica “chiusa” è rapidamente convertita, in condizioni fisiologiche, nella forma carbossilica “aperta”, che è inattiva e si lega in elevata percentuale all'albumina serica. Attualmente solo due derivati semisintetici della CPT (Topotecan ed Irinotecan) sono utilizzati nella pratica clinica per il trattamento di cancro ovarico, polmonare e colo-rettale. La recente risoluzione, mediante cristallografia a raggi X, della struttura tridimensionale di TopoI in complesso sia con la Camptotecina e il Topotecan che con derivati strutturalmente diversi (indolocarbazolici ed isochinolinici), ha fornito chiarimenti sulle caratteristiche dell'interazione enzima-inibitore. Tali informazioni costituiscono elementi molto utili nello studio dei veleni di TopoI con un approccio di tipo computazionale il cui scopo è comprendere in che modo queste molecole interagiscono con il loro target e progettare nuovi nuovi derivati come potenziali farmaci ad attività antitumorale. È stato quindi possibile individuare un nuovo farmacoforo sfruttando le cinque strutture cristallogra che disponibili, al fine di rintracciare un set di caratteristiche strutturali comuni a tutti i veleni di TopoI. Con lo scopo di disporre di nuovi derivati più semplici da ottenere dal punto di vista della sintesi ma che mantengano tutte le caratteristiche farmacoforiche richieste per la formazione di complessi ternari stabili con TopoI e DNA, è stata proposta la sintesi di analoghi “semplificati” della CPT. Si può infatti ipotizzare che una molecola non debba necessariamente possedere uno scaffold pentaciclico per legarsi al complesso binario TopoI-DNA, purchè mantenga un sistema planare aromatico per intercalare il DNA e opportuni gruppi funzionali in grado di interagire con specifici aminoacidi dell'enzima. Sulla base di questa assunzione, diversi possibili scaffold sono stati disegnati e sottoposti a studi di docking con diversi protocolli di ricerca per predire la loro capacità di formare stabili complessi ternari con TopoI e DNA. È stato inoltre condotto uno studio di docking molecolare per una serie di nuovi derivati della CPT sostituiti in posizione 5 (5-derivati) per descrivere la loro modalità di interazione con il complesso TopoI-DNA. In generale, l'introduzione di sostituenti in posizione 5 ha come risultato una diminuzione dell'attività citotossica rispetto alla CPT. La presenza di sostituenti lipofili di piccole dimensioni sembra essere tollerata all'interno del sito di binding, mentre l'introduzione di gruppi idro lici dà luogo ad una diminuzione dell'affinità. L'introduzione di gruppi stericamente ingombranti provoca la perdita di importanti interazioni al'interno del sito di legame. I risultati computazionali indicano come caratteristica generale che l'epimero ? dei 5-derivati ha un'affinità maggiore per il sito di binding rispetto all'epimero ?. Recentemente sono stati sintetizzati una serie di 16a-tio-CPT analoghi. I saggi biologici condotti su questi composti hanno rivelato che i tio-derivati sono potenti inibitori della TopoI ed hanno attività antitumorale maggiore rispetto ai loro oxo-analoghi, sia in vitro che in vivo. Al fine di razionalizzare la maggiore attività dei tio-analoghi rispetto ai derivati tradizionali, è stato eseguito uno studio computazionale volto sia a predire proprietá chimico-fisiche rilevanti per la descrizione del possibile profilo farmacocinetico delle nuove molecole, sia a descriverne la modalità di legame nel sito del complesso binario TopoI-DNA tramite studi di docking. I risultati di docking non hanno messo in evidenza differenze di rilievo tra i tio- e gli oxo-derivati in termini di modalità di binding e di docking score. Al contrario, i valori predetti per proprietà come la lipofilicità, la solubilità in acqua e la permeabilità cellulare indicano che il profilo farmacocinetico delle due classi di composti potrebbe essere significativamente diverso. Per le simulazioni di docking condotte sui 5-CPT-derivati e sui tio-CPT-derivati è stato utilizzato il protocollo quantum mechanics (QM)-polarized ligand docking (QPLD) (implementato nella suite Schrödinger) con lo scopo di aumentare l'accuratezza dei calcoli di docking. I metodi tradizionali utilizzati per il docking molecolare utilizzano una rappresentazione chimico-fisica approssimata delle interazioni proteina-ligando, dove le cariche atomiche sono calcolate in base al campo di forza. Il protocollo QPLD utilizza invece una metodologia ab initio per il calcolo delle cariche del ligando all'interno della cavità della proteina, tenendo in considerazione la polarizzazione di carica indotta dagli aminoacidi del sito di legame sul ligando. Il lavoro relativo ai 5-CPT-derivati e ai tio-CPT-derivati à stato supportato dall'azienda farmaceutica Indena S.p.A., Milano, Italia. Il lavoro è stato condotto in collaborazione con il gruppo del Professor Arturo Battaglia (Centro Nazionale Richerche Bologna) per la sintesi dei composti e con il gruppo del Professor Franco Zunino (Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori, Milano) per i saggi biologici.