Studio dell'espressione e della localizzazione di tre proteine, PTMA, PREP e DAAM1, per la prima volta associate alla spermatogenesi dei Vertebrati

Durante l’attività di ricerca svolta, come dottorando, nel gruppo del Prof. Sergio Minucci (Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università di Napoli), ho contribuito allo studio dell’espressione e della localizzazione di due proteine, prothymosin alpha (Parte I) e discevelled-associated activator of morphogenesis (Parte III), nella gametogenesi maschile. Inoltre, durante il periodo di studi all’estero presso la School of Medicine della Yale University (NH, Connecticut), ho analizzato il possibile coinvolgimento dell’enzima Prolil-endopeptidasi nella spermatogenesi, utilizzando modelli murini geneticamente modificati (Parte II). Parte I: Espressione e localizzazione di PTMA durante la spermatogenesi di Danio rerio La protimosina alfa (PTMA) è una proteina altamente acida (Frangou-Lazaridis et al., 1988), appartenente alle proteine intrinsecamente non strutturate (Gast et al., 1995), isolata per la prima volta nel timo di ratto. Caratterizzata inizialmente come un fattore immunogeno (Haritos et al., 1984a), presto è stata ritrovata in diversi tessuti dei Mammiferi (Haritos et al., 1984b; Clinton et al., 1989). La presenza di un segnale nucleare, oltre alla peculiare conformazione random coil, permettono a tale proteina di interagire con numerosi partner molecolari. PTMA è una molecola altamente conservata nella filogenesi e coinvolta in diversi processi biologici, come nell’interazione con l’istone H1 e il rimodellamento cromatinico (Karetsou et al., 1998; Ueda et al., 2012), la morte cellulare (Enkermann et al., 2000a; Jiang et al., 2003; Malicet et al., 2006; Ueda, 2009), la regolazione della trascrizione (Karetsou et al., 2002; Martini et al., 2000; Martini and Katzenellenbogen, 2003), lo sviluppo del cancro (Dominguez et al., 1993; Skopeliti et al., 2006; Tsitsiloni et al., 1993; Wu et al., 1997; Zhang et al., 2014), e l’immunità (Baxevanis et al., 1992; Pan et al., 1986; Voutsas et al., 2000). Dal 2002 il nostro gruppo ha iniziato uno studio di espressione e localizzazione di PTMA durante la spermatogenesi di diversi Vertebrati (Aniello et al., 2002; Ferrara et al., 2009; Prisco et al., 2009; Ferrara et al., 2010; Ferrara et al., 2013): l’espressione della proteina nelle cellule meiotiche e post-meiotiche dei testicoli e la sua presenza negli spermatozoi (associata con l’acrosoma, dove presente) rivelano un pattern molto conservato durante la filogenesi e suggeriscono un possibile ruolo per PTMA nella gametogenesi e nella fecondazione. Dato che alcuni Vertebrati mostrano un’associazione di PTMA e l’acrosoma (Ferrara et al., 2013), lo studio della proteina in modelli animali che presentano spermatozoi privi della suddetta struttura risulta particolarmente interessante. Per questo motivo è stato scelto il modello Danio rerio per continuare il progetto di ricerca (prima parte del lavoro di tesi), data la sua peculiare organizzazione dei testicoli in tubuli anastomizzati e principalmente per la caratteristica assenza dell’acrosoma nello spermatozoo (SPZ), il quale feconda l’uovo attraverso una penetrazione meccanica (Hirai, 1988). La localizzazione del trascritto di ptma nel testicolo di Danio rerio, presenta un pattern simile a quanto osservato in altre specie (Aniello et al., 2002, Ferrara et al., 2009; Prisco et al., 2009; Ferrara et al., 2010; Ferrara et al., 2013), in particolare nelle cellule meiotiche e post-meiotiche. I dati dell’analisi immunoistochimica mostrano che la proteina mantiene la propria localizzazione anche in questa specie. Infatti, risulta assente negli spermatogoni, suggerendo che essa non partecipa nella fasi proliferative, mentre la presenza della proteina negli spermatociti (SPC) primari e negli spermatidi (SPT) supporta un suo possibile ruolo durante la meiosi e/o nelle fasi di differenziamento degli SPT in SPZ. In particolare, la proteina è presente nel citoplasma degli SPC in leptotene/zigotene; in seguito Ptma estende la sua localizzazione alla regione cromatinica delle cellule in divisione, e mantiene la sua distribuzione nucleare anche durante il differenziamento degli SPT. La localizzazione nucleare in spermatozoi privi di acrosoma suggerisce un ruolo per Ptma nel rimodellamento cromatinico durante il differenziamento dei gameti. Questi dati, quindi, forniscono un’interessante punto di partenza per lo studio delle funzioni di Ptma nella riproduzione dei Vertebrati. Parte II: PREP è associato alle funzioni riproduttive maschili ed ai gameti maschili in topo La prolil endopeptidasi (PREP) è un membro della famiglia delle serina peptidasi molto conservato durante l’evoluzione (Venäläinen et al., 2004). PREP è coinvolto nella maturazione e degradazione di ormoni peptidici e neuropeptidi (Mentlein, 1988; Wilk, 1983), ma la sua attività è limitata a oligopeptidi composti da non più di trenta residui amminoacidici. Nonostante la sua localizzazione citoplasmatica, tale enzima può svolgere la propria attività esternamente alla cellula, inattivando neuropeptidi nell’ambiente extracellulare. Infatti, è stato suggerito che PREP può essere rilasciato dalle cellule (Ahmed et al., 2005), anche se non possiede un segnale di secrezione o una regione di interazione con la membrana plasmatica (Venäläinen et al, 2004). PREP è stato implicato in diversi processi biologici, come la maturazione e la degradazione di ormoni e neuropeptidi (Mentlein, 1988), apprendimento e memoria (Cunningham and O’Connor, 1997; D’Agostino et al., 2013), proliferazione cellulare e differenziamento (Matsubara et al., 1998; Suzuki et al., 2014), e nel metabolismo del glucosio (Kim et al., 2014). Ad oggi, alcuni studi hanno ipotizzato una partecipazione di PREP anche nei processi associati alla riproduzione (Kimura et al., 1998; Kimura et al., 2002). Allo scopo di approfondire un possibile ruolo della proteina nella riproduzione maschile, in questo seconda parte del lavoro di tesi sono stati esaminati gli effetti della sua mancata espressione genica, utilizzando topi transgenici PREP knockdown (Prepgt/gt), su testicoli e spermatozoi (SPZ). Dopo aver confermato la presenza dell’espressione di PREP nei testicoli e SPZ wild type (wt), rispetto ai campioni Prepgt/gt, è stata eseguita un’analisi comparata dei parametri macroscopici sui testicoli di wt e knockdown: i dati mostrano che le gonadi di Prepgt/gt presentano un peso e dimensione ridotta rispetto ai wt. Similmente, le analisi istologiche mostrano che, mentre la morfologia generale è preservata tra i due genotipi, il diametro e il lume dei tubuli sono ridotti nei topi Prepgt/gt, e che la percentuale di tubuli seminiferi spermiati è maggiore nei wt. Nella gonade maschile la proteina localizza negli spermatidi allungati e negli SPZ luminali dei topi wt, nelle cellule di Sertoli, Leydig e nelle cellule peritubulari. PREP è espresso anche negli SPZ epididimali, dove localizza nella testa e nel tratto intermedio del flagello, mentre nella restante regione della coda il segnale è ridotto. Come atteso, nei campioni knockdown sia nel testicolo che negli SPZ il segnale non è rilevabile. Questi dati suggeriscono che la endopeptidasi potrebbe essere associata alla maturazione dei gameti; infatti, a supporto di ciò, i dati finali ottenuti analizzando i parametri spermatici mostrano una riduzione della conta totale e della motilità, nonché una maggiore alterazione della normale morfologia nei topi Prepgt/gt, rispetto ai wt. Questi risultati suggeriscono che PREP potrebbe avere un ruolo fondamentale nella spermatogenesi di topo e nella motilità dello spermatozoo. Tuttavia, ulteriori esperimenti sono richiesti per comprendere se il ruolo di questo enzima nella spermatogenesi è svolto durante lo sviluppo testicolare o direttamente nella fisiologia del gamete maturo. Parte III: Espressione e localizzazione di DAAM1 durante la spermatogenesi di ratto e negli spermatozoi di uomo DAAM1 è una proteina appartenente alla famiglia delle formine, un gruppo di molecole che controllano la nucleazione e l’assemblaggio delle fibre di actina in risposta a diversi segnali (Kovar, 2006; Goode and Eck, 2007). Molti studi hanno mostrato che DAAM1 è coinvolto in processi biologici essenziali, come la polarità cellulare, il movimento e l’adesione durante la morfogenesi e organogenesi, così come l’organizzazione citoscheletrica (Zallen, 2007; Sato et al., 2006; Matusek et al., 2006; Aspenstrom et al., 2006; Lu et al., 2007; Yamashita et al., 2007). Il rimodellamento citoscheletrico è un processo mediante il quale le cellule modulano la loro architettura e forma in seguito a stimoli intracellulari e/o extracellulari. Come tutte le formine, DAAM1 possiede la capacità di nucleare filamenti di actina ed agire come regolatore del citoscheletro nel movimento e nella polarità cellulare. Sebbene il ruolo di questa proteina durante lo sviluppo sia stato ben studiato, la sua potenziale attività nei tessuti adulti resta ancora da esplorare. Fino ad oggi, non ci sono studi che mostrano un coinvolgimento di DAAM1 nei processi riproduttivi, tuttavia alcune molecole che sono coinvolte negli stessi pathway molecolari risultano espresse durante la spermatogenesi (Ma et al., 2006). Nel 2011, il nostro gruppo ha isolato un cDNA codificante DAAM1 dal testicolo di Pelophylax esculentus. I primi studi, condotti utilizzando questo modello, hanno mostrato che la proteina localizza nelle spermatocisti. In questa terza parte del lavoro di tesi lo studio è stato spostato su un altro modello, Rattus norvegicus, dato che in questa specie l’anatomia testicolare e gli eventi che avvengono durante la spermatogenesi sono rappresentatiti dei Mammiferi (Russell et al., 1989). Inizialmente, è stata confermata la presenza di DAAM1 nel testicolo di ratto a diversi stadi durante lo sviluppo post-natale (7-14-21-28-35-42-60 days post-partum, dpp), che ricapitola gli eventi chiave della prima ondata spermatogenetica. Allo scopo di caratterizzare un profilo di espressione della proteina e confermare il suo possibile coinvolgimento durante la spermatogenesi, è stata studiata la sua localizzazione durante lo sviluppo post-natale delle gonade di ratto, tramite immunofluorescenza. DAAM1 mostra una particolare distribuzione negli stadi analizzati: a 7 dpp, la proteina localizza nella regione centrale dei tubuli; a 14 dpp, il segnale è evidente negli spermatogoni A e B nella stessa regione centrale, fino ai 21- 28 dpp, quando il segnale si evidenzia negli spermatociti. Durante la spermioistogenesi (35 e 42 dpp), DAAM1 è presente negli spermatidi, con una peculiare localizzazione nella regione acrosomica in formazione. Infine a 60 dpp, quando la prima ondata spermatogenetica è completata, il segnale è presente anche negli spermatozoi (SPZ), a livello del residuo citoplasmatico. Dato il coinvolgimento di DAAM1 nel rimodellamento citoscheletrico, il profilo di localizzazione della formina è stato comparato con la distribuzione di altre proteine citoscheletriche: actina e tubulina. Il segnale dell’actina è simile a quello di DAAM1 durante le prime fasi dello sviluppo testicolare, ma essa è presente anche nelle cellule di Sertoli che iniziano a formare la barriera emato-testicolare; in seguito, a 35 dpp, il segnale è evidente nella barriera completata. Inoltre, durante la spermioistogenesi, l’actina localizza anche nelle cellule epiteliali che supportano il riarrangiamento cito-strutturale delle cellule germinali verso il lume (42 dpp). Nel testicolo adulto, l’actina è espressa in tutte le cellule, inclusi gli SPZ. La tubulina risulta espressa in tutte le fasi dello sviluppo, e localizza nelle cellule di Sertoli che svolgono un ruolo essenziale nel sostenere le cellule germinale durante il loro differenziamento in SPZ. Allo scopo di approfondire la localizzazione di DAAM1 nei gameti maschili, è stata eseguita un’analisi di immunofluorescenza su spermatozoi epididimali di ratto: i risultati mostrano che la proteina è presente nel flagello. Successivamente, l’analisi è stata estesa a SPZ eiaculati di uomo, dove la goccia citoplasmatica è spesso fisiologicamente ritenuta (WHO 2010; Mortimer & Menkveld, 2001). Infatti, è stata confermata la localizzazione di DAAM1 nel residuo citoplasmatico dei gameti umani. Infine, è stata condotta un‘analisi comparativa della localizzazione delle proteine citoscheletriche negli SPZ di ratto e uomo: in entrambe le specie l’actina localizza nella testa, nella regione acrosomale, e nella coda; mentre la tubulina è distribuita nel flagello. Questi risultati mostrano, per la prima volta, l’espressione e la localizzazione di DAAM1 durante la spermatogenesi di ratto e negli spermatozoi di ratto e uomo, e forniscono un profilo comparato della distribuzione della formina rispetto ai principali fattori che controllano la cito-architettura delle cellule germinali, suggerendo un suo possibile coinvolgimento nel rimodellamento morfo-funzionale e nell’organizzazione della gonade e dei gameti maschili.