STUDIO DI TRAFFICKING E POTENZIALE NEUROGENICO DELLA PROTEINA RICOMBINANTE UMANA TAT-OP1

La proteina osteogenica 1 (OP-1 o BMP-7) è un fattore di crescita multifunzionale di 431 amminoacidi appartenente alla famiglia delle proteine morfogenetiche dell’osso (BMP), un sottogruppo della superfamiglia del TGF-β. Secrete sottoforma di precursori fino a quattro volte più lunghi della forma matura, le BMP presentano all’estremità C-terminale un motivo contenente sette cisteine ..C…CXGXC…CC…CXCX.., che rappresenta la porzione attiva della molecola. Numerosi studi hanno dimostrato che le proteine BMP sono coinvolte non solo nello sviluppo della cartilagine e dell’osso ma anche nella formazione di tessuti di origine non osteogenica quali ad esempio il tessuto nervoso. Esse, infatti, sono coinvolte nelle prime fasi dello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) e partecipano al processo neurorigenerativo in età adulta. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio della proteina ricombinante umana di fusione hTAT-OP1, precedentemente preparata e caratterizzata su colture di preosteoblasti MC3T3E1. Il costrutto hTAT-OP1 è composto da 162 aminoacidi e comprende all’N-terminale (30 AA) una coda di 6 istidine seguita dalla sequenza TAT, un peptide che deriva dalle proteine del virus dell’HIV-1 ed è comunemente impiegato come dominio di trasduzione proteica, il sito di taglio per una peptidasi specifica (6 AA) e, al C-terminale, il dominio di sette cisteine (126 AA), essenziale per il corretto ripiegamento della proteina. La sua caratterizzazione ha previsto studi di trafficking cellulare, attività biologica come potenziale neurogenico su cellule di feocromocitoma di ratto PC12, una linea cellulare comunenemente usata per lo studio in vitro del differenziamento neurogenico. Lo studio di trafficking cellulare è stato eseguito mediante l’uso delle tecniche di western blotting e di immunofluorescenza. Dopo il trattamento di 24 ore con hTAT-OP1 (200nM), è stata dimostrata mediante western blotting la presenza intracellulare della proteina come molecola con peso molecolare di 18,5 kDa durante le prime 6 ore. Mediante l’impiego di anticorpi specifici per le sequenze his-tag e OP1, è stato dimostrato che il costrutto è tagliato in sede citoplasmatica in due peptidi, probabilmente a livello del sito peptidasico inserito nella regione N-terminale. Dopo 24 ore dal trattamento, la presenza di TAT è stata indirettamente determinata mediante il segnale di his-tag a livello nucleare mentre OP1 è stata osservata a livello della membrana citoplasmatica. Inoltre, la fosforilazione del complesso SMAD1/5/8, che agisce come secondo messaggero nella via del segnale BMP, ha confermato l’interazione della sequenza OP1 con i recettori di membrana BMPR, come dimostrato in parallelo per la proteina hBMP7. Successivamente, l’attività biologica come potenziale neurogenico è stata caratterizzata mediante studi di MTS, crescita neuritica ed espressione di neurofilamenti. Nessun effetto citotossico è stato osservato dopo 24 ore dall’inizio del trattamento, mentre una ridotta proliferazione cellulare è risultata a partire dalle 72 ore, e l’effetto è stato di tipo concentrazione dipendente. Inoltre, la combinazione di hTAT-OP1 con NGF ha comportato una più marcata riduzione della proliferazione in confronto con i campioni stimolati solo con hTAT-OP1. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i campioni trattati con NGF/hTAT-OP1 e NGF/hBMP7. Sebbene non sia stata osservata crescita neuritica dopo trattamento con la proteina hTAT-OP1 e hBMP7, un effetto precoce e stimolatorio è stato identificato a 24h nei campioni sottoposti al cotrattamento con hTAT-OP1 e NGF diversamente da quanto osservato nel controllo allestito con NGF dove la formazione dei neuriti è risultata in un tempo tardivo (7giorni). Il cotrattamento (hTAT-OP1+NGF) ha dimostrato, inoltre, di stimolare un’ alta espressione ed organizzazione dei neurofilamenti in confronto con le colture trattate solo con NGF. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che esiste una sinergia di azione nel differenziamento neurogenico tra hTAT-OP1 ed il fattore NGF, probabilmente dovuto ad un “crosstalk” tra le due vie di segnale e che tale sinergia comporta una più precoce crescita neuritica. Si intravedono prospettive applicative del costrutto hTAT-OP1 nel campo della rigenerazione ossea e neuronale.