EXCITATORY AND INHIBITORY SYNAPTIC TRANSMISSION AT CORTICAL SYNAPSES IN CaV2.1 KNOCK-IN MICE CARRYING FAMILIAL HEMIPLEGIC MIGRAINE MUTATIONS

L’emicrania emiplegica familiare di tipo 1 (FHM1), un raro sottotipo di emicrania con aura, è causata da mutazioni missense nel gene umano CACNA1A che codifica per la subunità α1 dei canali del calcio CaV2.1 (tipo P/Q) (Ophoff et al., 1996). Il mal di testa e i sintomi neurologici dell’aura che caratterizzano i tipici attacchi di FHM1 sono simili a quelli delle forme comuni di emicrania, eccetto per il sintomo dell’emiparesi (Pietrobon, 2007; Pietrobon and Striessnig, 2003). I canali CaV2.1 sono espressi nei terminali presinaptici e nelle membrane somatodendritiche di tutti i neuroni del cervello, dove svolgono un ruolo fondamentale nel controllo del rilascio di neurotrasmettitore. Le mutazioni FHM1 determinano un guadagno di funzione della corrente Ca2+ dei canali ricombinanti umani CaV2.1; in particolare causano un aumento dell’influsso di Ca2+ a livello di singolo canale in un ampio intervallo di potenziali vicini alla soglia di attivazione del canale, dovuto a un’aumentata probabilità d’apertura del canale, causata per lo più dallo spostamento della curva di attivazione del canale verso potenziali più negativi (Hans et al., 1999; Tottene et al., 2002, 2005; Pietrobon, unpublished data). In accordo con tali risultati, i topi omozigoti knock-in (KI) recanti la mutazione FHM1 R192Q (RQ/RQ) presentano, in granuli di cervelletto e in cellule piramidali corticali, un aumento della densità di corrente Ca2+ di tipo P/Q (Tottene et al., 2009; van den Maagdenberg et al., 2004). Questi topi mostrano, inoltre, una facilitazione dell’induzione e propagazione, in vivo, della cortical spreading depression (CSD: il fenomeno neurologico che causa l’aura e il possibile trigger del mal di testa emicranico) (Pietrobon, 2005, 2007; van den Maagdenberg et al., 2004). Per capire i meccanismi che determinano la facilitazione della CSD nei topi KI, in laboratorio abbiamo recentemente studiato la trasmissione sinaptica eccitatoria in neuroni corticali in microcoltura e in neuroni piramidali e interneuroni multipolari fast-spiking (FS) connessi tra loro sinapticamente in fettine acute talamo-corticali di topi KI RQ/RQ (Tottene et al., 2009). Lo studio della neurotrasmissione in microcolture di neuroni corticali ha rappresentato parte del mio progetto di Dottorato. I risultati hanno dimostrato un guadagno di funzione della neurotrasmissione eccitatoria dovuto a un aumentato influsso di Ca2+ evocato da potenziale d’azione, attraverso i canali del Ca2+ presinaptici di tipo P/Q, e a un’aumentata probabilità di rilascio di glutammato alle sinapsi delle cellule piramidali. Inoltre, usando un modello in vitro di CSD, abbiamo dimostrato una correlazione causale tra l’aumentato rilascio di glutammato alle sinapsi delle cellule piramidali e la facilitazione sperimentale della CSD nei topi KI RQ/RQ. Abbiamo costatato che la neurotrasmissione inibitoria alle sinapsi tra gli interneuroni multipolari FS e le cellule piramidali nelle fettine talamo-corticali di topi KI RQ/RQ era invece inalterata, sebbene la trasmissione sinaptica fosse controllata dai canali del Ca2+ di tipo P/Q (Tottene et al., 2009). Il suddetto effetto sinapsi-specifico delle mutazioni FHM1 consolida la visione dell’emicrania come un disordine episodico dell’eccitabilità cerebrale. Infatti, la distruzione del bilancio tra eccitazione e inibizione e la conseguente iperattività dei circuiti neuronali possono costituire, in risposta a specifici triggers, la causa degli episodi di suscettibilità all’innesco della CSD nell’emicrania. Mentre nei pazienti la mutazione R192Q causa tipici attacchi di FHM, la mutazione S218L causa una grave sindrome di emicrania emiplegica associata a convulsioni epilettiche, coma e grave edema cerebrale, dovuti spesso a traumi alla testa di lieve entità (Kors et al., 2001). La mutazione S218L, rispetto alla mutazione R192Q, determina un maggior spostamento verso potenziali più negativi della curva di attivazione dei canali umani ricombinanti CaV2.1 (Tottene et al., 2002, 2005). Inoltre, in accordo con il suddetto effetto, determina un maggior guadagno di funzione dell’influsso di Ca2+ nei neuroni a potenziali negativi e una maggiore facilitazione dell’induzione e propagazione della CSD in vivo nei topi omozigoti FHM1 KI S218L (SL/SL) rispetto ai topi KI RQ/RQ (van den Maagdenberg et al., 2004, 2010). L’effetto della mutazione S218L sulla corrente CaV2.1 Ca2+ neuronale e sulla facilitazione dell’induzione e propagazione della CSD risulta essere dipendente dal dosaggio allelico. Al fine di investigare i meccanismi che determinano la maggior facilitazione della CSD in topi KI SL/SL rispetto ai topi KI RQ/RQ, ho studiato la trasmissione sinaptica glutamatergica in neuroni piramidali corticali di topi eterozigoti KI S218L (SL/WT) cresciuti su microisole di cellule gliali in modo da formare sinapsi su se stessi (autapsi). Ho trovato un guadagno di funzione della neurotrasmissione corticale eccitatoria dovuto a un aumentato influsso di Ca2+ evocato da potenziale d’azione, attraverso i canali del Ca2+ presinaptici di tipo P/Q e a un’aumentata probabilità di rilascio di glutammato alle sinapsi delle cellule piramidali corticali dei topi KI SL/WT. Infatti, l’ampiezza della corrente postsinaptica eccitatoria evocata (EPSC) e il contributo dei canali Ca2+ di tipo P/Q alla trasmissione sinaptica erano entrambi aumentati alle sinapsi dei neuroni piramidali corticali in microcoltura. Inoltre ho dimostrato che la saturazione del sensore del Ca2+ avveniva a minor concentrazioni esterne di Ca2+ e che la paired pulse ratio (PPR) era diminuita. I cambiamenti nell’ampiezza dell’EPSC, nella Ca2+ dipendenza dell’EPSC e nella PPR, trovati nei topi KI SL/WT erano quantitativamente simili a quelli rilevati nei topi KI RQ/RQ. La mutazione S218L determina quindi un aumento maggiore dell’influsso di Ca2+ presinaptico e del rilascio di glutammato alle sinapsi corticali delle cellule piramidali rispetto alla mutazione R192Q che causa un fenotipo lieve di FHM1. Vista la correlazione causale tra l’aumentato rilascio di glutammato e la facilitazione sperimentale della CSD (Tottene et al., 2009), questo risultato potrebbe spiegare la maggior suscettibilità alla CSD indotta dalla mutazione S218L e il suo fenotipo grave. I dati hanno anche dimostrato che la trasmissione corticale eccitatoria in entrambi i topi FHM1 KI era meno suscettibile all’inibizione presinaptica conseguente all’attivazione dei recettori GABAB accoppiati a proteine G. Infatti, la frazione dell’EPSC inibito dal baclofen, agonista dei recettori GABAB, era minore nei topi KI SL/WT e KI RQ/RQ rispetto ai topi selvatici (WT) e, conseguentemente, la neurotrasmissione eccitatoria era ulteriormente facilitata in presenza di modulazione. I topi eterozigoti KI S218L e omozigoti KI R192Q presentavano una riduzione dell’inibizione presinaptica simile. I dati suggeriscono che l’iperattività dei circuiti corticali dovuta sia all’aumentato rilascio di glutammato dipendente dai canali CaV2.1, sia alla ridotta inibizione presinaptica del rilascio di glutammato durante neuromodulazione (attraverso l’attivazione di proteine G) possono rendere la corteccia dei pazienti FHM vulnerabile all’innesco della CSD in risposta a triggers emicranici. Un altro scopo del mio progetto di Dottorato consisteva nel determinare il meccanismo che causa l’effetto diverso della mutazione FHM1 R192Q sulla trasmissione sinaptica corticale eccitatoria e inibitoria, come descritto in Tottene et al. (2009). Ho studiato la neurotrasmissione inibitoria autaptica in singoli interneuroni corticali multipolari fast-spiking cresciuti su microisole di cellule gliali da topi WT e topi KI RQ/RQ. L’ampiezza media della corrente postsinaptica inibitoria (IPSC) evocata da potenziale d’azione era simile negli interneuroni multipolari dei topi WT e KI RQ/RQ, nonostante l’importante ruolo svolto dai canali Ca2+ di tipo P/Q nel controllo del rilascio di GABA a queste sinapsi. Ho trovato che il sensore del Ca2+ presinaptico, alle autapsi degli interneuroni multipolari nei topi WT, viene quasi saturato dall’influsso di Ca2+ evocato da potenziale d’azione. La mancanza del guadagno di funzione della neurotrasmissione inibitoria nei topi RQ/RQ KI non è comunque causata dalla saturazione del sensore Ca2+, poiché l’ampiezza dell’IPSC in interneuroni di topi WT e KI RQ/RQ era simile anche a basse concentrazioni di Ca2+ esterno. Ho costatato, infatti, una simile dipendenza dell’IPSC dalle concentrazioni esterne di Ca2+ alle autapsi degli interneuroni multipolari WT e KI RQ/RQ. Tali risultati suggeriscono che l’inalterata neurotrasmissione corticale inibitoria nei topi KI RQ/RQ sia dovuta soprattutto ad un aumento non significativo dell’influsso di Ca2+, evocato da potenziale d’azione attraverso i canali presinaptici CaV2.1 alle sinapsi degli interneuroni multipolari fast-spiking. Una possibile causa potrebbe essere la forma più corta del potenziale d’azione degli interneuroni FS e/o l’espressione, in questi interneuroni, di una variante di splicing della subunità α1 CaV2.1 poco influenzata dalla mutazione R192Q. L’inalterato influsso di Ca2+ evocato da potenziale d’azione attraverso i canali mutati presinaptici CaV2.1, alle sinapsi degli interneuroni multipolari FS, è probabilmente un effetto comune a tutte le mutazioni FHM1, poiché ho trovato inalterata anche la trasmissione sinaptica inibitoria alle autapsi degli interneuroni corticali multipolari FS nei topi eterozigoti KI S218L.