DNA Topoisomerasi IB umana: studi sul meccanismo catalitico e sulla farmaco-resistenza

La DNA topoisomerasi I (Top1p) catalizza cambiamenti nella topologia del DNA mediante la formazione di un intermedio covalente enzima-DNA, che è reversibilmente stabilizzato dall’ agente antitumorale camptotecina (CPT).Studi cristallografici di una Top1p, mancante della porzione N-terminale, legata covalentemente ad un filamento di DNA, mostrano una proteina monomerica che lega il substrato come una tenaglia. In questa struttura sono individuabili un dominio core, che costituisce insieme al domino C-terminale la parte globulare della proteina e un dominio linker. La CPT lega l’ intermedio covalente limitando la flessibilità del dominio linker e consentendone la cristallizzazione. Precedentemente abbiamo dimostrato che la mutazione del residuo Ala653 in Pro determina un incremento nella tasso di riligazione rendendo il mutante Top1A653Pp resistente alla CPT (Fiorani, et al., 2003).Studi di dinamica molecolare suggeriscono che questa mutazione si associa ad un incremento nella flessibilità del dominio linker capace di alterare l’ equilibrio della reazione catalizzato dalla Top1p. Tuttavia i dati derivanti da studi strutturali, biochimici e di dinamica molecolare, condotti su questa proteina, forniscono scarse evidenze sul fatto che la flessibilità del dominio linker possa influenzare la geometria del sito attivo. Per verificare se l’ incremento nel tasso di riligazione causato dalla mutazione A653P, potesse sopprimere il difetto nella riligazione indotto dalla mutazione T718A, localizzata nel sito attivo, abbiamo realizzato un doppio mutante Top1 A652P-T718Ap (DM).Il doppio mutante è vitale, cataliticamente attivo sia in vivo che in vitro e resistente alla CPT. Questi risultati suggeriscono l’esistenza di interazioni a lungo raggio tra il dominio linker ed il sito attivo. L’ attività specifica del doppio mutante, sia in vivo che in vitro, dimostra la presenza di una riduzione dell’ affinità per il DNA, supportando l’ipotesi secondo cui alterazioni nella flessibilità o nell’orientamento di questo dominio influenzino profondamente la geometria del sito catalitico, modificando la cinetica del taglio e della riligazione catalizzata dalla Top1p. La struttura cristallografica del complesso ternario, realizzata in presenza dell’ analogo della CPT topotecano (TPT), suggerisce la presenza di due classi di mutazioni capaci di indurre resistenza all’ azione dell’ inibitore. La prima classe include i cambiamenti nei residui che interagiscono direttamente con il farmaco, mentre la seconda comprende i residui che, se mutati, determinano un alterazione nelle interazione stabilite con il DNA e la tasca di legame della CPT. La mutazione Thr729Ala si trova entro un cluster idrofobico situato nel dominio Cterminale e come tale, appartiene ad una terza classe di mutazioni capaci di conferire resistenza alla CPT senza interagire direttamente con il farmaco o il DNA. La mutazione Thr729Ala è stata identificata per la prima volta in linee cellulari tumorali PC-7/CPT resistenti al CPT-11( ironotecano un analogo della CPT) (Kubota et al., 1992). Tuttavia, i nostri dati rivelano che gli stessi effetti non sono evidenziabili se l’ enzima viene espresso nel lievito Saccaromyces cerevisiae. Se si osserva la struttura proteica il residuo Thr729 è distante dal sito di legame del farmaco per cui non è chiaro come una sua mutazione possa modificare la dinamica dell’ interazione tra CPT e complesso binario. La Thr729 si trova nel dominio C-terminale a 12.4 Å dalla tirosina catalitica e 13,1Å dal residuo Asn722 che stabilisce un legame mediato dall’ acqua con la CPT. La mutazione Asn722Ser, che determina un accorciamento della catena laterale, induce una condizione di resistenza (Fertala et al., 2000). Redinbo e coautori hanno ipotizzato che le basi della resistenza alla CPT, causata da mutazioni del residuo 729, siano dovute ad uno spostamento del residuo Asn722 con conseguente soppressione del legame con le CPTs (Chrencik, et al., 2004). per confermare questa ipotesi abbiamo analizzato il comportamento di altre tre sostituzioni: Lys, Pro e Glu. Queste sostituzioni sono state scelte per la loro carica positiva o negativa, nel caso della Lys e del Glu, e per la capacità di distorcere l’?-elica nel caso della Pro. I risultati dimostrano che il residuo Thr729 svolge un ruolo chiave nel mantenimento della corretta geometria della tasca idrofobica collocata nella regione C-terminale. Infatti, la mutazione Thr729Ala produce un’ enzima che presenta un attività in vivo, in vitro e una sensibilità alla CPT del tutto paragonabili all’ enzima WT. Quando la Thr729 è mutata in Lys o Glu si evidenzia una condizione di resistenza alla CPT ,che si traduce in una sensibilità alterata nel caso della mutazione Thr729Pro. Inoltre, il mutante Thr729Glu evidenzia forti difetti nell’ interazione con il substrato suggerendo che il mantenimento della corretta geometria della regione C-terminale è necessario per preservare le interazioni tra l’enzima ed il DNA durante la progressione del ciclo catalitico. Gli esperimenti di dinamica molecolare forniscono un‘interpretazione strutturale e dinamica del ruolo svolto dalla Thr729 nelle interazioni a lungo raggio presenti tra proteina e DNA (Chillemi et al. 2008). La catena laterale della Thr729 forma un legame idrogeno con il gruppo idrossilico della Tyr619, stabilizzando i contatti tra dominio C-terminale e la regione del subdominio III. La struttura più completa della Top1 contiene una porzione dell’ N-terminale che va dal residuo Ile 215 alla Gly201. Questi quindici aminoacidi sono impaccati vicino al subdominio I, al dominio C-terminale e alla regione hinge ove costituiscono un cluster idrofobico conservato in tutte le topo isomerasi IB eucaristiche (Redinbo et al., 2000). Questa porzione del dominio N-terminale interagisce con l’?-elica del perno ed, in particolare, il Trp 205 è vicino all’ Arg434, situata all’ inizio dell’ elica hinge. All’apice dell’hinge è presente un loop piegato contenete la Pro431. Per verificare se tale caratteristica strutturale è causata dalla presenza della prolina abbiamo mutato questo residuo in glicina, un aminoacido privo di catena laterale. In questo modo è possibile valutare se il ripiegamento del loop è causato dalla prolina e se tale conformazione possiede un significato funzionale. Per chiarire il ruolo delle interazioni presenti tra questa regione e la porzione N-terminale della proteina tutti i mutanti sono stati realizzati nella forma full lenght e Topo70. Inoltre il residuo Arg434 è stato mutato in Ala e Cys. La prima sostituzione è stata scelta per la sua capacità di alterare l’ intorno chimico sia strutturalmente che elettrostaticamente , la seconda per la capacità di formare un ponte disolfuro nel doppio mutante W205C-R434C, in cui la regione perno è ancorata covalentemente al domini N-terminale. Tutti i mutanti risultano letali quando espressi in lievito, la loro letalità non è dipendente dalla presenza del dominio N-terminale, poiché anche i mutanti Topo70 sono incapaci di formare colonie in condizioni di espressione. Tutte le proteine presentano una riduzione nell’ attività specifica, che tuttavia, non è associata ad un calo nell’ affinità per il substrato. Nelle cinetiche di rilassamento in eccesso di DNA, i mutanti presentano un comportamento distributivo. Nel caso dei mutanti del residuo 434 questa perdita di attività è associata ad uno spostamento dell’ equilibrio di reazione verso il taglio, come confermato dai saggi di taglio. I mutanti Top1P431Gp e Top1P431G70-p presentano difetti nel rilassamento del DNA probabilmente imputabili ad alterazioni nel controllo della rotazione del filamento a valle del sito di taglio. Nei saggi di taglio per entrambi è presente un basso ma riproducibile accumulo di complessi in assenza dell’ inibitore. Per il mutante Top1P431Gp i prodotti della reazione sono localizzati nella parte superiore del gel e corrispondenti a frammenti di DNA più lunghi di 100 coppie di basi. Nel caso del mutante Top1P431G70-p i prodotti di reazioni sono posizionati nella metà inferiore del gel e quindi equivalenti a frammenti di DNA corti. Questi risultati confermano la presenza di interazioni tra dominio N-terminale e regione hinge; inoltre suggeriscono che la regione N-terminale controlli la specificità del riconoscimento modulando la qualità e il tipo d’interazione tra enzima e DNA.