Temporary renal reperfusion to increase safe ischemic time

SOMMARIO Introduzione L’incidenza di insufficienza renale (i.r.) post-operatoria in pazienti sottoposti a chirurgia dell’aorta toraco-addominale è riportata essere dal 5 al 40 % a seconda delle casistiche associata ad un tasso di mortalità intorno al 70%. I pazienti che sviluppano una insufficienza renale acuta post-operatoria sviluppano più frequentemente complicanze non renali come ad esempio insufficienza respiratoria, disfunzioni del sistema nervoso centrale, sepsi ed emorragie gastrointestinali. I fattori che contribuiscono al danno renale dopo chirurgia aortica includono il danno da ischemia e riperfusione, il flusso non pulsato di alcuni sistemi di riperfusione, condizione renale preoperatoria, perdite ematiche etc. L’ischemia (interruzione del flusso ematico a livello del parenchima renale), seguita dalla riperfusione (ripristino del flusso), provocano dei danni caratteristici ad organi e tessuti. L’ischemia compromette il continuo rifornimento di ossigeno ai tessuti necessario per il mantenimento delle normali funzioni fisiologiche. La riperfusione però, necessaria per il mantenimento della vitalità cellulare, è essa stessa causa di danno cellulare attraverso la produzione di radicali liberi dell’ossigeno e attivazione di una risposta infiammatoria mediata dalle citochine che da un lato, attraverso l’espressione della componente pro-infiammatoria (IL1?, IL1?, IL,2, IL6, GM-CSF, TNF?, INF?) sostiene il danno e dall’altro, attraverso l’espressione della sua componente anti-infiammatoria (IL4, IL10) tende ad arginarlo costituendo il preludio al ritorno alla condizione di normalità. Attualmente la metodica chirurgica utilizzata presso la Clinica di Chirurgia Vascolare ed Endovascolare dell’Università degli studi di Padova nella prevenzione dell’insufficienza renale è rappresentata dall’utilizzo della riperfusione breve delle arterie renali che consiste nel riperfondere le arterie renali per 3 minuti, una volta completata l’anastomosi prossimale della ricostruzione aortica, attraverso degli shunt temporanei inseriti nella protesi. Tale riperfusione permette di poter clampare per ulteriori 30 minuti di ischemia le arterie renali permettendo di poter completare l’intervento. Qualora necessario è possibile inoltre riperfondere per ulteriori 3 minuti le arterie renali per ottenere ulteriori 30 minuti di ischemia. Scopo di questo studio è dimostrare nel modello animale che è possibile incrementare il tempo di ischemia totale renale ristabilendo per 3 minuti un flusso pulsato all’interno dell’arteria renale, valutando i danni funzionali, morfologici ed i processi molecolari legati ad essi. La riperfusione breve delle arterie renali può essere ripetuta più volte raggiungendo un tempo di ischemia totale di 90 minuti. Materiali e metodi Lo studio è stato condotto su 27 ratti albini del ceppo Sprague-Dawley di sesso maschile e del peso di 250 gr circa .Dopo aver praticato una laparotomia mediana si è proceduto all’isolamento e al clampaggio dell’arteria renale bilateralmente ottenendo l’ischemia completa dei reni seguita da riperfusione secondo il protocollo. Gli animali sono stati suddivisi in 4 gruppi sperimentali; un gruppo di controllo, 18 ratti, (sottoposti ad un clampaggio di tempo crescente delle arterie renali per valutare la gravità del danno ischemico a tempi differenti pari a 30-35-40-45-50-55-60-75-90 minuti. Un gruppo A, 4 ratti (sottoposti a 30 minuti di ischemia seguiti da 3 minuti di riperfusione e successivi 30 minuti di ischemia per un totale di 60 minuti), un gruppo B, 4 ratti, (sottoposti a due periodi di ischemia di 45 minuti intervallati da 3 min di riperfusione per un totale di 90 minuti di ischemia); un gruppo C, 3 ratti, (sottoposti a tre periodi di ischemia di 30 minuti ognuno interrotti da 3 min di riperfusione per un totale di 90 minuti di ischemia). Prima dell’ischemia è stato eseguito un prelievo venoso dalla cava per il dosaggio della creatinina sierica. In seconda giornata post-operatoria i ratti sono stati sottoposti a riapertura della ferita chirurgica, con espianto di entrambi i reni e sacrificio dell’animale previo prelievo venoso dalla cava. Il materiale prelevato è stato inviato presso i laboratori di Anatomia Patologica per una valutazione mediante microscopia ottica. La valutazione del danno renale è stata eseguita controllando i parametri di funzionalità renale (creatininemia a 0 e 48 ore dall’evento ischemico), i parametri morfologici di danno sugli esami istologici (la necrosi, la dilatazione tubuale, le mitosi, apoptosi, dimorfismi, stravasi ematici, infiltrato infiammatorio) e l’indice proliferativo (Ki67). Inoltre è stata valutata l’espressione delle interleuchine pro-infiammatorie (IL1?, IL1?, IL,2, IL6, GM-CSF, TNF?, INF?) ed anti-infiammatorie (IL4, IL10) Risultati La valutazione della creatinine mia a 0 e 48 ore ha evidenziato come la riperfusione temporanea sia in grado di proteggere funzionalmente il parenchima renale. A 90 minuti i ratti riperfusi mostrano valori di creatininemia sovrapponibili ai valori di base preischemici mentre i ratti non riperfusi a 90 minuti hanno un aumento significativo della creatininemia. Da un punto di vista morfologico la valutazione a 60 minuti documenta l’assenza di lesioni. Quando il tempo di ischemia è prolungato a 90 minuti, anche se da un punto di vista funzionale non vi è evidenza di alterazioni, l’analisi istopatologica ha dimostrato un danno seppur lieve sia in termini di necrosi che di apoptosi. Tuttavia a 90 minuti si osserva un alto indice proliferativi in tutti gli animali sottoposti a riperfusione con il più alto valore che si riscontra nei ratti sottoposti a doppia riperfusione. Le citofhine pro-infiammatorie (IL-1?, IL-2, IL-6, GM-CSF, IFM-? ,TNF-?: ) ed antiinfiammatorie (IL-10, IL-4) sono espresse dai vari gruppi di animali dopo ischemia e dopo ischemia e riperfusione. Sia le citochine pro che antiinfiammatorie sono sovra espresse negli animali sottoposti ad una ischemia totale di 60 minuti con singola riperfusione confrontati con il gruppo senza riperfusione e con quelli con ischemia di 90 minuti. La valutazione delle citochine dimostra una prevalenza di citochine antinfiammatorie nel gruppo rivascolarizzato con una differenza statisticamente significativa per IL10. Nelle riperfusioni a 90 minuti si è osservato un decremento sia per quel che riguarda le citochine pro che antinfiammatoria . Tuttavia con la doppia riperfusione il decremento era più marcato per le citochine proinfiammatorie (TNF?) permettendo l’esplicarsi dell’attività biologica della IL10. Discussione I risultati della mia tesi di dottorato dimostrano come i risultati funzionali, morfologici e molecolari siano congrui. A 60 minuti di ischemia vi è la comparsa di un donno parenchimale irreversibile con incremento del dosaggio della creatininemia sierica, dei processi di apoptosi e necrosi cellulare, basso indice proliferatici ed un incremento del livello di espressione delle citochine. A tale riguardo tale incremento riguarda in particolar modo l’espressione delle citochine pro-infiammatorie (IL1?, IL1?, IL,2, IL6, GM-CSF, TNF?, INF?). Nel caso di ischemia e riperfusione con pattern 30-3-30 è stato osservato un minor danno ischemico accompagnato ad una risposta proliferativa pronunciata ed a una sovraespressione di citochine anti-infiammatorie (IL10, IL4). Il bilancio finale è in favore del ruolo protettivo della riperfusione. Con il modello di riperfusione di 90 minuti di ischemia e 6 di riperfusione (30-3-30-3-30) si osservano ancora i risultati positivi della riperfusione con una riduzione della necrosi, ed un incremento dell’attività proliferativi con un rapporto favorevole verso la produzione di citochine antinfiammatorie (IL10). Nel pattern dei 90 minuti di ischemia e 3 di riperfusione (45-3-45), abbiamo osservato un danno ischemico simile in termini di necrosi ed apoptosi ed un indice proliferativo più basso ed un rapporto tra citochine pro ed anti infiammatorie a favore di quelle antinfiammatorie. Tuttavia il decremento delle citochine pro-infiammatorie TNF è risultato essere meno evidente, contrastando così in maniera più attiva il ruolo antinfiammatorio di IL10. Si può concludere,in accordo con i risultati presentati, che il miglior modello di riperfusione risulta essere quello di ischemia / riperfusione 30-3-30-3-30 accompagnato da meno danno ischemico associato ai benefici della riperfusione.