Ruolo delle proteine del tegumento nelle interazioni tra il virus dell’Herpes simplex di tipo1 e il pathway dei Multivesicular bodies

Molti virus dotati di envelope completano il proprio ciclo replicativo formando delle vescicole che gemmano attraverso membrane cellulari di varia natura, ma la scissione del virione da tali membrane non è un passaggio semplice o spontaneo. Per quel che riguarda diversi virus a RNA, tra cui retrovirus, rabdovirus, filovirus, arenavirus e, presumibilmente, orto- e paramixovirus, tale problema è stato risolto mediante il reclutamento di fattori normalmente utilizzati dalla cellula durante la formazione di vescicole interne a specifici organelli membranosi derivati dagli endosomi: i multivesicular bodies (MVB). In effetti, la gemmazione dei virus a RNA dotati di envelope e la formazione delle vescicole interne ai MVB sono processi analoghi: in entrambi i casi si verifica una curvatura della membrana in allontanamento dal citoplasma. Affinché un’infezione possa considerarsi produttiva, quindi, è necessario che tutti i componenti utili alla formazione della particella siano convogliati a livello della membrana in cui si verificherà l’evento di gemmazione. A questo scopo, i virus a RNA hanno evoluto due possibili strategie: la presenza di particolari sequenze note come Late domain (L-domain) all’interno delle proprie proteine strutturali e/o la loro ubiquitinazione; in entrambi i casi le proteine coinvolte vengono reclutate nel pathway dei MVB. Molto meno è noto, invece, per quel che riguarda gli herpesvirus e, più in generale, i virus a DNA dotati di envelope. Infatti, se da un lato le fasi iniziali dell’infezione erpetica sono piuttosto conosciute, dall’altro rimangono aperte alcune controversie riguardanti il sito cellulare di assemblaggio e acquisizione del pericapside nonché la natura delle membrane implicate nella gemmazione della particella virale dalla cellula infetta. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di contribuire al chiarimento dei meccanismi molecolari dell’assemblaggio e della gemmazione degli herpesvirus, prendendo come modello il virus dell’herpes simplex di tipo 1 (HSV-1). In particolar modo, due lavori pubblicati nell’ultimo periodo hanno evidenziato un possibile ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di HSV-1 sottolineando l’importanza di una corretta biogenesi di tali organelli per garantire la gemmazione virale e il corretto trafficking intracellulare di una proteina virale essenziale, quale la glicoproteina B. Sulla base di tali riscontri si è deciso di valutare se le membrane dei MVB costituissero il sito di reclutamento di altre importanti proteine strutturali, quali quelle del tegumento, cosìda poter identificare tali organelli come il sito di acquisizione del pericapside e di assemblaggio definitivo della particella virale. Nel presente lavoro ci siamo focalizzati soprattutto su quattro proteine del tegumento di HSV-1: VP1/2, VP13/14, VP16 e VP22. In particolar modo, abbiamo dimostrato che VP1/2 e VP16 presentano al proprio interno sequenze riconducibili a L-domain noti e che sia VP1/2 che VP16 localizzano a livello delle membrane dei MVB. Il reclutamento di VP1/2 a livello di tali organelli può essere attribuito, almeno in parte, all’interazione tra il dominio PSAP in essa contenuto e la proteina Tsg101, suo partner cellulare, con cui abbiamo dimostrato l’associazione. Viceversa, le cause della localizzazione di VP16 non sono altrettanto chiare. Infatti, abbiamo dimostrato che VP16 non presenta alcuna interazione diretta tra il dominio PPLY in essa presente e i corrispondenti partner cellulari, i membri della famiglia delle ubiquitino-ligasi Nedd4. Inoltre, in base ai nostri dati, la medesima proteina non risulta nemmeno ubiquitinata, modifica post-traduzionale che ne garantirebbe il direzionamento ai MVB. Nell’ipotesi che il suo reclutamento ai MVB sia di tipo indiretto e dovuto all’azione di altre proteine virali, abbiamo quindi verificato alcune tra le interazioni riportate in letteratura per quel che riguarda VP16 e le altre proteine del tegumento, in particolare VP13/14 e VP22. Dai nostri esperimenti è emerso che VP16 interagisce direttamente con VP22, in assenza di altri fattori virali, ma non con VP13/14. Tuttavia, nemmeno il legame con VP22 è risultato tale da giustificare la localizzazione intracellulare di VP16, che quindi potrebbe richiedere fattori virali e/o cellulari diversi da quelli analizzati. Infine, mediante studi più approfonditi su VP22 e VP13/14, abbiamo dimostrato che entrambi tali proteine risultano ubiquitinate e che, nel caso specifico di VP13/14, tale ubiquitinazione è del tipo generalmente responsabile del direzionamento di una proteina al pathway dei MVB. In conclusione, i nostri dati dimostrano che almeno quattro proteine del tegumento sono effettivamente reclutate ai MVB o possiedono le caratteristiche necessarie ad una simile localizzazione, quali la presenza di L-domain o la coniugazione all’ubiquitina. E’ quindi possibile supporre che tali organelli, oltre a rappresentare una potenziale via d’uscita dalla cellula infettata, possano fornire anche la “piattaforma” cellulare adatta al completamento dell’assemblaggio del tegumento e all’acquisizione del pericapside da parte della particella virale.