Genome-wide patterns of genetic variation among wild and cultivated grapevines (V. vinifera L.)

La diffusione geografica e l’importanza economica della viticoltura fanno della vite euroasiatica (V. vinifera L.) una delle specie più importanti per l’agricoltura mondiale. La maggior parte dei vitigni coltivati appartengono alla sottospecie V. vinifera subsp. sativa, la quale si ritiene sia stata domesticata nel vicino Oriente dalla vite selvatica (V. vinifera subsp. sylvestris) intorno al IV millenio a.C. Tuttavia, studi recenti hanno sollevato l’ipotesi di eventi di domesticazione secondaria della vite coltivata in Europa occidentale. Si pensa che il passaggio da viti selvatiche dioiche a viti con fiori ermafroditi sia stato fondamentale per la domesticazione della vite, dal momento che la capacità di produrre frutti per autofecondazione garantiva una produttività superiore e costante di uva. Altrettanto importante è stata la selezione per caratteristiche dell’uva di immediata percezione, come per esempio la dimensione della bacca ed il suo contenuto zuccherino. Studi aggiuntivi sulle relazioni genetiche tra la vite coltivata e la sua forma spontanea sono necessari allo scopo di chiarire la serie di incertezze che ancora persistono sull’origine della vite domestica ed incentivare il miglioramento genetico della viticoltura attuale. Pertanto, il principale obiettivo del presente lavoro di tesi è stato la caratterizzazione della variabilità fenotipica e genetica di una collezione di viti coltivate e selvatiche. L’intera popolazione è stata genotipizzata con il nuovo GrapeReSeq 20K SNP chip, ottenendo una matrice finale di 16 mila marcatori SNP di alta qualità. Allo stesso tempo, un nuovo protocollo della tecnologia RAD-seq è stato messo a punto con lo scopo di incrementare la densità dei marcatori molecolari lungo il genoma di vite. In seguito all’applicazione di questa nuova procedura di RAD-seq all’intera collezione di viti, circa 37 mila marcatori SNP sono stati identificati, mettendo in evidenza una cospicua diversità genetica tra la vite coltivata ed il suo presunto progenitore. L’unione delle due matrici di marcatori SNP, seguita dalla rimozione dei loci con un tasso di dati mancanti superiore a 0.2 ed una frequenza dell’allele minore (MAF) inferiore a 0.05, ha portato alla formazione di un panel definitivo di circa 27 mila marcatori SNP, equamente distribuiti lungo il genoma di vite. Questo panel finale di marcatori SNP è stato utilizzato per analizzare la struttura della popolazione attraverso due approcci complementari, ossia l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’approccio bayesiano implementato nel programma fastSTRUCTURE. In accordo con quanto riportato in letteratura, entrambe le strategie hanno messo in evidenza una chiara e moderata differenziazione tra le accessioni di V. sativa e V. sylvestris. Pertanto, l’estensione del Linkage Disequilibrium (LD), espresso sottoforma del classico coefficiente di correlazione r2, è stata valutata nell’intera collezione e nei due sottogruppi separatamente. Il valore di r2 è risultato inferiore ad una soglia di 0.2 dopo circa 10 kb nel germoplasma completo e dopo 20 kb nella sottopopolazione delle viti selvatiche. Questa discrepanza di valori di LD nelle viti spontanee può essere legata alla ridotta dimensione della popolazione effettiva ovvero alla mancanza di scambio di materiale genetico (gene-flow) tra popolazioni diverse di V. sylvestris. In seguito, la differenziazione genetica tra le viti coltivate e selvatiche lungo il genoma è stata misurata sottoforma di indice di fissazione (FST) per individuare regioni genomiche con frequenze alleliche divergenti tra le due sottospecie. Il valore medio di FST pari a 0.12 ha suggerito una moderata differenziazione genetica tra le accessioni di sativa e sylvestris, indicando come tra di esse si verifichino frequenti eventi di ibridazione. Tuttavia, circa 2 mila marcatori SNP hanno mostrato un elevato livello di differenziazione tra le viti coltivate e selvatiche (FST > 0.27), come confermato dal test di permutazione. 1,714 geni annotati sono stati identificati in linkage con i suddetti marcatori SNP, mostrando un significativo arricchimento in funzioni geniche predette legate al metabolismo dell’azoto e dei carboidrati, e ai meccanismi di risposta ed adattamento agli stimoli ambientali. Una lieve riduzione della diversità nucleotidica della vite selvatica (πsylvestris/ πsativa ~0.95) è stata osservata nella maggior parte delle suddette regioni geniche con un ruolo nella risposta a stress biotici ed abiotici. Pertanto, una pressione selettiva sta probabilmente operando nelle popolazioni di V. sylvestris per l’adattamento ai sempre più frequenti cambiamenti climatici. Questo risultato sottolinea l’importanza della vite selvatica come putativa fonte di geni e/o alleli di resilienza, i quali potrebbero essere stati persi dalla vite coltivata durante il processo di domesticazione. L’approccio di genome-wide association study (GWAS) è stato, in seguito, applicato come strategia alternativa per l’identificazione dei geni e delle mutazioni selezionati durante la domestizatione della vite. Pertanto, l’intera collezione di viti coltivate e selvatiche è stata fenotipizzata per il peso della bacca e del grappolo, il numero di grappoli per pianta, la produttività, e la composizione chimica della bacca (contenuto in zuccheri, acidi organici e potassio, acidità titolabile e pH). Un elevata variabilità fenotipica è stata osservata tra e all’interno dei due sottogruppi di vite, soprattutto per i caratteri peso della bacca, pH, contenuto in acidi organici e acidità titolabile. Il test di associazione, corretto per la struttura della popolazione e le relazioni di parentela, ha identificato correlazioni significative marcatore-carattere per tutti i fenotipi studiati, ad eccezione del peso della bacca. Geni codificanti per fattori di trascrizione e per proteine coinvolte nel metabolismo del calcio e delle poliammine sono stati identificati in linkage con i marcatori SNP significativamente associati ai caratteri produttività e peso del grappolo. Inoltre, il test di associazione ha consentito l’identificazione di geni coinvolti nel controllo del pH e dell’acidità totale della bacca, come per esempio i geni codificanti per la subunità A3 della pompa protonica vacuolare ovvero per l’isocitrato liasi. In conclusione, il presente lavoro di ricerca ha dimostrato per la prima volta come la genetica di popolazione e l’ association mapping siano due validi approcci per individuare le basi genetiche della variabilità fenotipica osservata in un sistema genetico complesso come la vite. Inoltre, sono state fornite evidenze dell’importanza della vite selvatica come modello per lo studio dei meccanismi di adattamento agli stress ambientali. Questi risultati rappresentano la base per comprendere come le viti selvatiche e coltivate reagiscano agli stimoli ambientali, nell’ottica di sviluppare nuovi programmi di miglioramento genetico della vite ed affrontare gli attuali cambiamenti climatici e la crescente richiesta di una viticoltura sostenibile.