Conditional inactivation of Emilin1 and Col6a1 genes

Tecniche che prevedono il controllo dell’espressione genica tramite inattivazione condizionale sono di particolare utilità nello studio della funzione di geni durante lo sviluppo e nel determinare patologie. In questo lavoro sono stati utilizzati un sistema di silenziamento in vivo del gene Col6a1 mediante RNAi utlizzando vettori lentivirali e un sistema “Cre/loxP” per generare un modello murino di knockout condizionale inducibile. L’uso di vettori lentivirali può accelerare la generazione di animali transgenici con una consistente riduzione dell’espressione genica e in modo inducibile, anche se in letteratura alla tecnica sono state attribuite alcune limitazioni dovute alla bassa efficienza di transgenesi e alla presenza di mosaicismo nei topi così ottenuti. In questo lavoro abbiamo prodotto diverse linee di animali transgenici con diminuiti livelli di messaggero per il gene Col6a1 grazie alla produzione di siRNA. La caratterizzazione delle varie linee e la comparazione del fenotipo con quello dei topi knockout per lo stesso gene ha permesso l’identificazione dei diversi fattori che sono in grado di influire sul processo di silenziamento di Col6a1, un gene codificante per una proteina della matrice extracellulare con un complesso pattern di espressione tessuto specifica. I risultati ottenuti con i vettori pLVTHM e pLVPT-rtTRKRAB, hanno permesso di definire tre importanti fattori come maggiori determinanti nell’efficienza dell’interferenza: la scelta della sequenza interferente, il numero di copie provirali integrate nel genoma e il sito di integrazione degli stessi. É stato inoltre utilizzato un vettore lentivirale (pLVPT-rtTRKRAB) per la produzione inducibile di shRNA mediante somministrazione di doxyciclina. Il controllo dell’espressione dopo doxycicilina è risultato essere stringente in molti tessuti, anche se in alcuni la inattivazione della produzione di shRNA non è stata completa. I risultati ottenuti dimostrano l’applicabilità di vettori lentivirali nella generazione di animali transgenici (Frka, Facchinello, et al., 2009). Emilina1 è una proteina della matrice extracellulare presente nei tessuti connettivi interstiziali e nel sistema cardiovascolare a partire da stadi precoci di sviluppo embrionale e nell’adulto. I topi mancanti di Emilina1 sono ipertesi e mostrano un diametro ridotto dei vasi. Emilina1 svolge la sua funzione regolando la biodisponibilità di TGF-β, una citochina che svolge importanti funzioni nel sistema cardiovascolare. In particolare, è stato dimostrato che Emilina1 inibisce la proteolisi del precursore pro-TGF-β a LAP/TGF-β, un complesso dal quale il fattore di crescita attivo deve essere successivamente rilasciato per permetterne il legame con il recettore. In assenza di Emilina1, la quantità di TGF-β attivo è aumentata, riducendo la proliferazione delle cellule muscolari lisce e quindi il diametro del vaso. Per stabilire se il fenotipo dei topi Emilina1-/- è il risultato di un’alterata morfogenesi dei vasi o se la funzione della proteina è richiesta nella regolazione della pressione e nella struttura del vaso anche nell’animale adulto, è stato necessario produrre un knockout condizionale del gene di Emilin1 in modo da indurre l’assenza della proteina con un preciso controllo temporale e spaziale. Il modello murino prevede la presenza di siti loxP posti nel gene di Emilin1 in modo da produrre l’inattivazione genica, una Cre-ERT2 (cioè una Cre ricombinasi inducibile tramite tamoxifen) e il locus Rosa26R-lacZ (un gene reporter inducibile per la rilevazione istologica delle cellule nelle quali si è avuto il riarrangiamento genetico). É stato preparato un costrutto dove l’esone 1 e 2 del gene di Emilina1 sono fiancheggiati da due siti loxP. Mediante Southern Blot e PCR, è stata verificata la corretta integrazione del costrutto nelle cellule embrionali staminali di topo. 4 cloni ricombinanti omologhi così identificati sono stati trasferiti in vivo mediante microiniezione in blastocisti ottenendo topi chimerici con un grado di chimerismo compreso tra il 10 e il 100%. L’espressione del gene Cre-ERT2 è stato posto sotto il controllo delle sequenze promotoriali proprie di Emilina1 o, alternativamente, del gene per la catena pesante della miosina di muscolo liscio, in modo da essere attivamente espressa dalle cellule che producono Emilina1 o da quelle muscolari lisce rispettivamente. Dopo la somministrazione di tamoxifen, l’attività di entrambi i promotori è evidente sia nelle cellule muscolare lisce vascolari e viscerali, dove SMMHC-CreERT2 induce una ricombinazione più efficiente rispetto al costrutto Emilina1-CreERT2. Le analisi mediante PCR e RT-PCR confermano che la cre ricombinasi sotto il promotore della miosina di muscolo liscio induce efficientemente la ricombinazione dei siti loxP nel locus di Emilina1, permettendo in questo modo una riduzione consistente dei livelli di messaggero. I topi Emilina1flox/flox generati sono fertili e presentano un fenotipo normale e inoltre comparati con degli animali di controllo non mostrano differenze per quanto riguarda l’espressione del messaggero di Emilina1 e nei livelli di pressione sanguigna, confermando che l’introduzione dei siti loxP non interferisce con la regolazione dell’espressione del gene. Risultati preliminari inoltre indicano un aumento della pressione sanguigna nelle doppie linee transgeniche Emilina1flox/flox e SMMHC-Cre-ERT2 in seguito a trattamento con tamoxifen. Questo risultato suggerisce che l’ipertensione non è dovuta ad un’alterata morfogenesi dei vasi sanguigni, ma al ruolo continuativo di Emilina-1 nella regolazione della pressione sanguigna anche nell’adulto.