STRATEGIES FOR THE IDENTIFICATION OF ALLELES INVOLVED IN HEREDITARY BREAST CANCER

Il tumore della mammella e’ la neoplasia più frequente nelle donne dell’Occidente. Ad oggi sono stati identificati alcuni fattori di rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria, ma il maggiormente significativo è la presenza di storia familiare, che è associata alla presenza nei membri della famiglia di alterazioni germinali predisponenti. Fino ad oggi sono stati identificati alcuni geni responsabili dell’aumento di rischio per lo sviluppo del tumore della mammella, tra cui i più rilevanti sono i geni ad alta penetranza BRCA1 e BRCA2. Tuttavia più del 70% dell’eccesso di rischio che si riscontra in casi familiari di tumore della mammella rispetto la popolazione generale non trova ad oggi un riscontro in alterazioni genetiche predisponenti. Durante il mio dottorato mi sono occupata dell’identificazione di alterazioni genetiche coinvolte nella predisposizione e progressione del tumore eredo-familiare della mammella in cui sono state escluse mutazioni chiaramente patogenetiche dei geni BRCA1/BRCA2. In un primo progetto ho partecipato alla caratterizzazione del ruolo patogenetico della variante BRCA1 p.Val1688del, identificata come variante di incerto significato clinico (Unclassified Variant, UV) e riscontrata frequentemente in pazienti provenienti dalla regione Veneto. In assenza di un chiaro effetto deleterio sulla funzionalità della proteina, le UV non possono essere utilizzate per l’identificazione e la sorveglianza degli individui ad alto rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria. Allo scopo di chiarire il ruolo patogenetico della delezione p.Val1688del, abbiamo utilizzato un approccio multi fattoriale, descritto da Golgar et al. (2004), attraverso il quale evidenze di diversa natura vengono integrate per derivare un rapporto di probabilità in favore della patogenicità o neutralità della variante. A questo scopo, i membri di 12 famiglie portatrici della variante sono stati analizzati per ottenere dati quali la co-segregazione della variante con il fenotipo tumorale, la co-presenza di mutazioni patogenetiche nel gene BRCA1, l’istopatologia del tumore, la perdita di eterozigosi (LOH) e la conservazione filogenetica del residuo aminoacidico alterato. Assunta l’indipendenza delle evidenze raccolte, i rapporti di probabilità associati a ciascuna evidenza sperimentale e clinica sono stati combinati, ottenendo un valore di 349000:1 in favore del ruolo patogenetico della variante, che supera di molto il cut off di 1000:1 stabilito per poter classificare la variante come alterazione predisponente. Il secondo progetto di cui mi sono occupata riguarda la definizione del profilo genetico della linea cellulare di carcinoma mammario HCC1500, derivata da una paziente con probabile tumore eredo-familiare della mammella. Nonostante l’età precoce di insorgenza e la storia familiare di tumore della mammella e del colon, il coinvolgimento dei geni BRCA1, BRCA2 e TP53 è stato escluso mediante screening mutazionale. La linea HCC1500 è stata quindi analizzata mediante due approcci complementari: i) l’identificazione di mutazioni nonsenso mediante l’utilizzo di un’approccio di analisi recentemente descritto chiamato GINI (Gene Identification by NMD Inhibition; Noesie and Dietz, 2001), e ii) l’identificazione di alterazioni numeriche mediante l’utilizzo di array per la genotipizzazione di un elevato numero di SNP, una recente tecnologia che permette un’elevata risoluzione di analisi. Mediante questo approccio è stato possibile identificare singoli geni mutati con specifiche alterazioni puntiformi o a causa di più estesi riarrangiamenti genomici. In particolare, nel gene PNLIPRP3 abbiamo identificato una sostituzione intronica che, modificando lo splicing del pre-mRNA, potrebbe dare origine ad un trascritto con mutazione troncante. Inoltre, l’elevata risoluzione dell’analisi per lo studio delle alterazioni cromosomiche numeriche, ci ha permesso di identificare singoli o pochi geni coinvolti in delezioni in omozigosi, amplificazioni di piccole regioni e riarrangiamenti intragenici derivanti da eventi di amplificazione o delezione. Sulla base di criteri quali la funzione biologica e mutazioni ritenute rilevanti per la selettività con cui alterano specifiche regioni codificanti, abbiamo selezionato alcuni geni che, prioritariamente ad altri, andrebbero confermati e analizzati in maggior dettaglio con ulteriori studi.. Un terzo progetto che ho seguito direttamente, ma che comunque non tratterò nella mia tesi, riguarda l’identificazione di fattori genetici coinvolti nella modificazione del rischio per i soggetti portatori di mutazione BRCA1 e BRCA2. Tale progetto si inserisce nell'ambito di un consorzio internazionale, denominato CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2; (Chenevix-Trench et al., 2007). SNP identificati prevalentemente attraverso studi di associazione genome-wide sono stati genotipizzati in 213 carriers di mutazione BRCA1/2 della nostra casistica mediante discriminazione allelica con sonde TaqMan. L’analisi statistica è stata effettuata sui dati genotipici provenienti da più di 30 gruppi di lavoro, permettendo la raccolta di dati derivanti da migliaia di individui. In questo modo è possibile ottenere la potenza statistica necessaria per l’identificazione dell’associazione tra polimorfismi con debole effetto e un aumentato rischio di sviluppo del tumore della mammella in specifiche sottoclassi di soggetti già portatori di mutazione nei geni ad alta penetranza BRCA1/2. Effettuati su più di 9400 e 5600 carriers di mutazione rispettivamente di BRCA1 e BRCA2, tali studi hanno permesso di identificare un’associazione significativa tra gli SNP rs3817198 (LPS1) e rs13387042 (2q35) ed un aumentato rischio in soggetti portatori di mutazioni BRCA2, e, nel secondo caso BRCA1 o BRCA2. L’identificazione e studio di fattori genetici modificatori permetterà di acquisire una più approfondita conoscenza della predisposizione e patogenesi del tumore della ereditario mammella, ma anche di stimare con migliore precisione il rischio di sviluppo della neoplasia così come di fornire utili informazioni per l'identificazione di nuovi approcci terapeutici.