A PATHOGENIC ROLE FOR MITOCHONDRIA IN COLLAGEN VI MUSCULAR DYSTROPHIES

I mitocondri sono organelli essenziali nella vita e nella morte delle cellule. Giocano, infatti, un ruolo chiave sia nella conservazione dell’energia (sottoforma di ATP), che nelle vie di segnale che causano la morte della cellula. La morte cellulare è un processo regolato da molteplici meccanismi ed eventi, tra cui uno dei più importanti è la transizione di permeabilità, ovvero l’aumento improvviso della permeabilità della membrana mitocondriale interna a soluti con massa inferiore a circa 1500 Da. Questo fenomeno è causato dall’apertura di un canale ad alta conduttanza presente nella membrana interna, il poro di transizione di permeabilità (PTP). L’apertura del PTP provoca, nei mitocondri, una serie di effetti a catena, come la depolarizzazione, il rigonfiamento osmotico e il rimodellamento delle cristae, che termina con la rottura della membrana mitocondriale esterna e il conseguente rilascio di proteine pro-apoptotiche nel citoplasma. Il PTP, negli ultimi anni, ha acquisito un ruolo sempre più importante nella patogenesi di diverse malattie, tra cui un esempio interessante è rappresentato dalle distrofie muscolari da deficit di collagene VI. La distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD) e la miopatia di Bethlem (BM) sono due patologie ereditarie causate da mutazioni nei geni che codificano per il collagene VI, un’importante proteina della matrice extracellulare. Studi condotti sul modello murino per queste patologie (il topo Col6a1-/-) e su pazienti affetti da UCMD, hanno evidenziato, a livello dei muscoli scheletrici, un aumento dell’apoptosi spontanea, di alterazioni ultrastrutturali dei mitocondri e del reticolo sarcoplasmatico e la presenza di una disfunzione mitocondriale latente con anormale apertura del PTP. Inoltre, è stato dimostrato che il trattamento con ciclosporina (Cs) A, un farmaco immunosoppressore usato nella terapia antirigetto per i trapianti che desensibilizza il PTP attraverso il legame con la ciclofilina (CiP)-D, causa il recupero delle alterazioni muscolari sia nei topi Col6a1-/- che nei pazienti. E’, però, importante sottolineare che la CsA lega e inibisce non solo la CiP-D, ma anche gli altri membri della famiglia delle ciclofiline (16 proteine diverse), i quali sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Non è, perciò, possibile separare gli effetti causati dall’inibizione della CiP-D da quelli sulle altre ciclofiline. Inoltre, la CsA inibisce anche la calcineurina, una fosfatasi coinvolta nei meccanismi che influenzano la crescita e lo sviluppo del muscolo scheletrico e la morfologia dei mitocondri, quest’ultima attraverso l’azione su una proteina (dynamin related protein-1) importante per la fissione mitocondriale. Il primo obiettivo del lavoro presentato in questa tesi è stato quello di chiarire se gli effetti terapeutici della CsA, riscontrati nelle distrofie muscolari da deficit di collagene VI, dipendessero unicamente dalla desensibilizzazione del PTP attraverso il legame con la CiP-D, oppure se fossero dovuti all’azione di questo farmaco su altri bersagli cellulari. A questo proposito, topi Col6a1-/- sono stati incrociati con topi Ppif-/- (Ppif è il gene che codifica per la CiP-D) in modo da ottenere topi Col6a1-/-Ppif-/- con entrambi i geni inattivati. I topi Col6a1-/-Ppif-/- sono stati studiati per valutare se l’assenza di Cip-D causasse il recupero del fenotipo patologico. Questi animali non presentavano degenerazione a livello delle fibre muscolari, né disfunzioni mitocondriali o difetti ultrastrutturali, e i livelli di apoptosi erano normali. Si è giunti, perciò, ad alcune conclusioni: (i) la mancanza di CiP-D equivale alla sua inibizione da parte della CsA nella cura del fenotipo distrofico murino, (ii) esiste una relazione causa-effetto tra la regolazione del PTP da parte della CiP-D e la patogenesi delle distrofie muscolari da deficit di collagene VI, e (iii) la CiP-D e il PTP possono essere considerati validi bersagli farmacologici per la terapia di queste distrofie. Il secondo obiettivo del lavoro è stato quello di valutare gli effetti terapeutici su topi Col6a1-/-di un derivato della CsA, la D-metilalanina3-etilvalina4-ciclosporina o Debio 025, il quale mantiene la proprietà di inibire le ciclofiline, ma non la calcineurina. Abbiamo, quindi, studiato, la traslocazione calcineurina-dipendente di NF-AT, l’attivazione dei linfociti T, la probabilità di apertura del PTP in mitocondri isolati e fibre muscolari, ultrastruttura e grado di apoptosi spontanea a livello dei muscoli scheletrici, prima e dopo la somministrazione, a topi Col6a1-/-, di Debio 025. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il trattamento con Debio 025: (i) non inibisce la calcineurina, ma ha potere desensibilizzante sul PTP; (ii) previene la disfunzione mitocondriale, normalizza i livelli di apoptosi spontanea e i difetti ultrastrutturali dei topi distrofici. Quindi, la desensibilizzazione del PTP può essere ottenuta grazie all’inibizione della Cip-D senza l’azione sulla calcineurina. Questi dati sono la prova che il Debio 025 ha effetti terapeutici sul modello animale per le distrofie da deficit di collagene VI e rappresentano, inoltre, un importante passo avanti verso una possibile terapia a lungo termine per i pazienti affetti da UCMD o BM, dato che il Debio 025 è privo di effetti immunosoppressori. Una terza questione analizzata è stata, infine, se l’anomala depolarizzazione mitocondriale presente nelle cellule di pazienti affetti da deficit di collagene VI fosse una caratteristica distintiva di queste patologie, argomento dibattuto in una recente pubblicazione. Abbiamo, perciò, studiato la risposta mitocondriale nelle colture cellulari primarie ottenute da biopsie muscolari di pazienti UCMD e BM, in risposta a diversi stimoli e in funzione del numero di passaggi in coltura. I nostri risultati indicano che la disfunzione mitocondriale viene persa dopo 7 passaggi in coltura e che, dopo questo tempo, le cellule risultano meno sensibili a diversi stimoli apoptotici. Questi dati sono compatibili con una selezione delle cellule resistenti all’apoptosi, che probabilmente erano già presenti fin dall’inizio in coltura, ma in numero limitato. Quindi, la disfunzione mitocondriale, e in generale la presenza di un fenotipo patologico, dovrebbero essere analizzati in colture giovani; infine, il numero di passaggi è un fattore critico da considerare quando vengono paragonati studi su diversi pazienti e su diverse patologie.