L’impiego di cellule staminali per scopi terapeutici è stato proposto come una soluzione promettente per la rigenerazione o la sostituzione di tessuti malati; tuttavia, i potenziali benefici presentano limitazioni legate principalmente alla scarsa disponibilità e ad aspetti di sicurezza clinica connessi alla qualità delle cellule. Scopo del progetto di ricerca è lo sviluppo di tecnologie per la coltura di cellule staminali umane per migliorare l’efficienza e la qualità dei prodotti finali nei processi di espansione e differenziamento. In particolare sono stati progettati un bioreattore a sei pozzetti con un volume di 10ml/pozzetto, per colture in sospensione di cellule staminali ematopoietiche derivate dal cordone ombelicale e un hydrogel microstrutturato per il controllo del differenziamento cardiaco di corpi embriodi derivati da cellule staminali embrionali umane. Un obiettivo generale è sfruttare i piccoli volumi richiesti dalle tecnologie proposte per la valutazione simultanea di un’ampia gamma di condizioni di coltura, soluzione che presenterebbe costi proibitivi con volumi di centinaia di millilitri. Una prospettiva particolarmente promettente per quanto riguarda la terapia cellulare è il trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Le cellule CD34+ derivate da sangue di cordone ombelicale costituiscono una risorsa di cellule staminali ematopoietiche utilizzabili per trapianti. Tuttavia, sia per l’esiguo numero di cellule che possono essere ottenute da una singola unità di cordone, sia per la difficoltà di controllare il fenotipo cellulare risultante a seguito di protocolli di espansione in vitro, l’attuale impiego terapeutico di cellule staminali ematopoietiche isolate da sangue di cordone ombelicale è rivolto soltanto a pazienti pediatrici. In questo contesto, è stato realizzato un bioreattore con un sistema di agitazione per espandere cellule CD34+ derivate da sangue di cordone ombelicale e studiare gli effetti dell’ipossia nell’espressione di marcatori di staminalità. E' noto infatti che l’ossigeno favorisce il rinnovamento cellulare durante l’ematopoiesi. Il sistema di mescolamento è stato realizzato in modo da poter essere applicato su di una piastra convenzionale a sei pozzetti, sia per uniformità con i sistemi di coltura statici convenzionali che per la conservazione dei protocolli di coltura. I volumi del bioreattore (10 ml/pozzetto) sono adatti per l’espansione delle cellule e per analisi multiparametriche mediante tecniche di citofluorimetria. Il sistema di mescolamento favorisce l’omogeneità all'interno del volume di coltura, permettendo così di poter controllare la concentrazione di ossigeno disciolto nell’immediato microambiente cellulare. Analisi di citofluorimetria evidenziano che cellule CD34+ coltivate in condizioni di ipossia rimangono vitali nel corso dell’intera durata degli esperimenti e presentano una maggiore espressione del c-kit rispetto alle cellule coltivate nelle condizioni di coltura convenzionali. In questo studio, sfruttando il vantaggi offerti dall’impiego di tecnologie avanzate che hanno consentito di ottenere un ambiente di coltura altamente definito da un punto di vista chimico – fisico, siamo stati in grado di esplorare la relazione tra l’espressione di c-kit e le condizioni di ossigeno. Questi risultati aprono nuove prospettive nello studio dei meccanismi di interazione tra l’ossigeno e le vie biologiche dipendenti da c-kit a livello molecolare. Il trapianto di cellule sta emergendo come possibilità promettente anche per la sostituzione di tessuto cardiaco danneggiato o malfunzionante in un cuore malato. Le cellule staminali embrionali umane, in grado di rinnovarsi indefinitamente mantenendo inalterata la loro capacità di differenziare in tutti i tipi cellulari dei tre foglietti germinativi, compresi i cardiomiociti, rappresentano una delle fonti più promettenti per lo sviluppo di nuovi approcci alla terapia cellulare. Tuttavia, L’impiego di cellule staminali embrionali umane è limitato dal lento progresso nello sviluppo di protocolli per l’espansione e il differenziamento in vitro. In questo contesto, abbiamo progettato un sistema di coltura che ci consentisse di esplorare gli effetti della concentrazione locale di fattori endogeni nel microambiente cellulare sul differenziamento delle cellule staminali embrionali umane. In particolare, abbiamo sviluppato un array di micropozzetti su hydrogel come piattaforma sperimentale. Nel nostro sistema, è possibile ipotizzare che la diffusione di fattori solubili nell’hydrogel tridimensionale porti a un accumulo dei fattori stessi in tempi rilevanti per i processi di proliferazione e differenziamento cellulare. Nelle condizioni di coltura descritte, l’aggregazione di corpi embriodi è impedita e singoli corpi embrioidi possono essere isolati e raccolti con una micropipetta per ulteriori analisi, senza interferire con la coltura. Nello studio, è stato analizzato il profilo di differenziamento dei corpi embrioidi confinati nei microwells di diversa profondità (450 μm e 1 mm) a confronto con quello delle cellule coltivate su piastre non aderenti convenzionali. L’analisi dell’espressione genica dell’intero genoma mediante microarray dimostra che il controllo della disponibilità locale di fattori endogeni nel microambiente cellulare induce differenze significative nel differenziamento delle cellule staminali embrionali umane. In particolare, il confinamento dei corpi embrioidi nei micropozzetti promuove l’espressione di geni coinvolti nei processi di specificazione della compartimentazione dell’embrione, mentre sistemi di coltura convenzionali promuovono l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo del cuore. Ulteriori esperimenti sarano necessari per comprendere in modo approfondito i meccanismi alla base dei risultati ottenuti e per studiare la distribuzione spaziale di marcatori dei tre foglietti germinativi. La tecnologia dei micropozzetti può essere utilizzata per ottenere un alto numero di corpi embrioidi separati e di dimensione definita e per valutare gli effetti del diverso microambiente sul differenziamento delle cellule. Questa tecnologia è inoltre adatta per modulare la disponibilità di fattori morfogenici e chiarire i meccanismi del differenziamento delle cellule staminali. I piccoli volumi richiesti per ottenere centinaia di corpi embrioidi rendono questo approccio uno strumento da prendere in considerazione quando si vogliano sviluppare protocolli di differenziamento in vitro.

Multiscale technologies for human stem cell culture in suspension: applications for hematopoietic and cardiac differentiation

ZAGALLO, MONICA
2011

Abstract

L’impiego di cellule staminali per scopi terapeutici è stato proposto come una soluzione promettente per la rigenerazione o la sostituzione di tessuti malati; tuttavia, i potenziali benefici presentano limitazioni legate principalmente alla scarsa disponibilità e ad aspetti di sicurezza clinica connessi alla qualità delle cellule. Scopo del progetto di ricerca è lo sviluppo di tecnologie per la coltura di cellule staminali umane per migliorare l’efficienza e la qualità dei prodotti finali nei processi di espansione e differenziamento. In particolare sono stati progettati un bioreattore a sei pozzetti con un volume di 10ml/pozzetto, per colture in sospensione di cellule staminali ematopoietiche derivate dal cordone ombelicale e un hydrogel microstrutturato per il controllo del differenziamento cardiaco di corpi embriodi derivati da cellule staminali embrionali umane. Un obiettivo generale è sfruttare i piccoli volumi richiesti dalle tecnologie proposte per la valutazione simultanea di un’ampia gamma di condizioni di coltura, soluzione che presenterebbe costi proibitivi con volumi di centinaia di millilitri. Una prospettiva particolarmente promettente per quanto riguarda la terapia cellulare è il trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Le cellule CD34+ derivate da sangue di cordone ombelicale costituiscono una risorsa di cellule staminali ematopoietiche utilizzabili per trapianti. Tuttavia, sia per l’esiguo numero di cellule che possono essere ottenute da una singola unità di cordone, sia per la difficoltà di controllare il fenotipo cellulare risultante a seguito di protocolli di espansione in vitro, l’attuale impiego terapeutico di cellule staminali ematopoietiche isolate da sangue di cordone ombelicale è rivolto soltanto a pazienti pediatrici. In questo contesto, è stato realizzato un bioreattore con un sistema di agitazione per espandere cellule CD34+ derivate da sangue di cordone ombelicale e studiare gli effetti dell’ipossia nell’espressione di marcatori di staminalità. E' noto infatti che l’ossigeno favorisce il rinnovamento cellulare durante l’ematopoiesi. Il sistema di mescolamento è stato realizzato in modo da poter essere applicato su di una piastra convenzionale a sei pozzetti, sia per uniformità con i sistemi di coltura statici convenzionali che per la conservazione dei protocolli di coltura. I volumi del bioreattore (10 ml/pozzetto) sono adatti per l’espansione delle cellule e per analisi multiparametriche mediante tecniche di citofluorimetria. Il sistema di mescolamento favorisce l’omogeneità all'interno del volume di coltura, permettendo così di poter controllare la concentrazione di ossigeno disciolto nell’immediato microambiente cellulare. Analisi di citofluorimetria evidenziano che cellule CD34+ coltivate in condizioni di ipossia rimangono vitali nel corso dell’intera durata degli esperimenti e presentano una maggiore espressione del c-kit rispetto alle cellule coltivate nelle condizioni di coltura convenzionali. In questo studio, sfruttando il vantaggi offerti dall’impiego di tecnologie avanzate che hanno consentito di ottenere un ambiente di coltura altamente definito da un punto di vista chimico – fisico, siamo stati in grado di esplorare la relazione tra l’espressione di c-kit e le condizioni di ossigeno. Questi risultati aprono nuove prospettive nello studio dei meccanismi di interazione tra l’ossigeno e le vie biologiche dipendenti da c-kit a livello molecolare. Il trapianto di cellule sta emergendo come possibilità promettente anche per la sostituzione di tessuto cardiaco danneggiato o malfunzionante in un cuore malato. Le cellule staminali embrionali umane, in grado di rinnovarsi indefinitamente mantenendo inalterata la loro capacità di differenziare in tutti i tipi cellulari dei tre foglietti germinativi, compresi i cardiomiociti, rappresentano una delle fonti più promettenti per lo sviluppo di nuovi approcci alla terapia cellulare. Tuttavia, L’impiego di cellule staminali embrionali umane è limitato dal lento progresso nello sviluppo di protocolli per l’espansione e il differenziamento in vitro. In questo contesto, abbiamo progettato un sistema di coltura che ci consentisse di esplorare gli effetti della concentrazione locale di fattori endogeni nel microambiente cellulare sul differenziamento delle cellule staminali embrionali umane. In particolare, abbiamo sviluppato un array di micropozzetti su hydrogel come piattaforma sperimentale. Nel nostro sistema, è possibile ipotizzare che la diffusione di fattori solubili nell’hydrogel tridimensionale porti a un accumulo dei fattori stessi in tempi rilevanti per i processi di proliferazione e differenziamento cellulare. Nelle condizioni di coltura descritte, l’aggregazione di corpi embriodi è impedita e singoli corpi embrioidi possono essere isolati e raccolti con una micropipetta per ulteriori analisi, senza interferire con la coltura. Nello studio, è stato analizzato il profilo di differenziamento dei corpi embrioidi confinati nei microwells di diversa profondità (450 μm e 1 mm) a confronto con quello delle cellule coltivate su piastre non aderenti convenzionali. L’analisi dell’espressione genica dell’intero genoma mediante microarray dimostra che il controllo della disponibilità locale di fattori endogeni nel microambiente cellulare induce differenze significative nel differenziamento delle cellule staminali embrionali umane. In particolare, il confinamento dei corpi embrioidi nei micropozzetti promuove l’espressione di geni coinvolti nei processi di specificazione della compartimentazione dell’embrione, mentre sistemi di coltura convenzionali promuovono l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo del cuore. Ulteriori esperimenti sarano necessari per comprendere in modo approfondito i meccanismi alla base dei risultati ottenuti e per studiare la distribuzione spaziale di marcatori dei tre foglietti germinativi. La tecnologia dei micropozzetti può essere utilizzata per ottenere un alto numero di corpi embrioidi separati e di dimensione definita e per valutare gli effetti del diverso microambiente sul differenziamento delle cellule. Questa tecnologia è inoltre adatta per modulare la disponibilità di fattori morfogenici e chiarire i meccanismi del differenziamento delle cellule staminali. I piccoli volumi richiesti per ottenere centinaia di corpi embrioidi rendono questo approccio uno strumento da prendere in considerazione quando si vogliano sviluppare protocolli di differenziamento in vitro.
30-gen-2011
Inglese
bioreactor, hematopoietic stem cells, cord blood, oxygen, c-kit, human embryonic stem cells, endogenous factor, hydrogel, cardiac differentiation
Università degli studi di Padova
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/107330
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIPD-107330