Symbiotic and associated bacteria in Tephritid flies

I Tefritidi, noti anche come “fruit fly”, rappresentano una vasta famiglia di Ditteri comprendenti specie dannose per l’agricoltura quali la mosca dell’olivo (Bactrocera oleae), la mosca del ciliegio (Rhagoletis cerasi), la mosca del noce (R. completa) e la mosca mediterranea della frutta (Ceratitis capitata). L’importanza delle associazioni batteriche nella famiglia dei Tefritidi è nota sin da quando Petri, all’inizio del secolo scorso, riportò la presenza di un battere simbionte, in seguito designato “Candidatus Erwinia dacicola”, in un diverticolo del capo della mosca dell’olivo chiamato bulbo esofageo. I successivi studi hanno evidenziato, sia con metodi tradizionali, sia con un approccio di tipo molecolare, lo stretto legame esistente tra batteri e tefritidi, siano essi simbionti ereditari e coevoluti e non coltivabili o semplici batteri associati. Nel presente lavoro sono stati analizzati in dettaglio alcuni aspetti delle relazioni batteriche in alcune specie di tefritidi, quali la variabilità genetica dei simbionti, la composizione della microflora batterica e la presenza di trasmissione attraverso i diversi stadi di sviluppo dell’ospite. La tesi si articola in cinque capitoli. Il primo lavoro analizza la variabilità genetica nel battere simbionte di B. oleae “Ca. Erwinia dacicola” in diverse popolazioni italiane della mosca dell’olivo, usando il gene ribosomale 16S come marcatore. Lo studio ha evidenziato la presenza di soli due aplotipi del simbionte, evidenziando anche che la loro presenza contemporanea all’interno di uno stesso ospite sembra in base a tutti i reperti non essere non essere probabile. La distribuzione di queste due linee batteriche nelle popolazioni di B. oleae sembra inoltre non essere casuale, poiché le popolazioni delle due maggiori isole italiane (Sardegna e Sicilia) ospitano uno o l’altro dei due aplotipi. Al contrario, le popolazioni della penisola ospitano, in proporzioni significativamente diverse, entrambi gli aplotipi del simbionte. Non è emersa una correlazione tra gli aplotipi di “Ca. E. dacicola” e gli aplotipi mitocondriali del loro ospite. Tale risultato potrebbe essere spiegato ammettendo l’esistenza, oltre alla prevalente trasmissione verticale, di accidentali passaggi orizzontali del simbionte. Nel secondo lavoro l’indagine è stata estesa a un areale più ampio circummediterraneo della mosca dell’olivo. I due aplotipi di “Ca Erwinia dacicola” rinvenuti in Italia sono stati riscontrati con frequenze diverse anche in Africa. Inaspettatamente gli aplotipi del simbionte risultano essere più correlati al territorio di quanto non lo siano i numerosi aplotipi mitocondriali dell’ospite. Nel terzo lavoro è stata indagata la composizione della microflora di R. completa e R. cerasi prelevate in natura, analizzandone i diversi stadi di sviluppo sia con approccio tradizionale coltura-dipendente che con approccio molecolare coltura-indipendente. Dal lavoro è emerso che le entità batteriche predominanti presenti nel bulbo esofageo appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae. I risultati ottenuti evidenziano un meccanismo di trasmissione dei batteri diverso da quello evidenziato per i simbionti della mosca dell’olivo e della sottofamiglia Tephritinae. Nel quarto lavoro è stata studiata l’abilità di ceppi di Klebsiella isolati originariamente dal bulbo esofageo di R. completa e C. capitata di incorporare il gene per l’espressione di una proteina fluorescente (GFP) e quindi la capacità del battere cosi modificato di ri-colonizzare l’ospite originario. Questa tecnica non distruttiva ha consentito il monitoraggio del destino dei batteri nel corso degli stadi di sviluppo dell’insetto. I batteri modificati sono stai ingeriti con successo dalle mosche del noce e ne hanno colonizzato in modo stabile l’intestino medio allo stadio di larva e quindi nella pupa. Si tratta del primo caso in cui un battere tipico della microflora di un tefritide è stato ingegnerizzato con successo e quindi introdotto nell’ospite nativo. La tecnica utilizzata in questo studio potrebbe costituire un valido strumento per espandere questo tipo di ricerca anche al controllo biologico di altre specie dannose in agricoltura. L’ultimo lavoro fa parte parzialmente della tesi di dottorato della Dott.ssa Isabel Martinez-Sañudo, per il quale ho contribuito nella parte sperimentale. L’obbiettivo principale di questo studio è stato quello di indagare le relazioni filogenetiche tra le mosche della sottofamiglia delle Tefritine e i loro batteri simbionti. Alcune specie di questa sottofamiglia sono infatti note per ospitare un simbionte specifico ereditario e non coltivabile (‘‘Candidatus Stammerula spp.”) nell’intestino medio. Tali batteri simbionti sono presenti solo in due delle cinque tribù della sottofamiglia studiate. L’analisi della cofilogenesi ha rivelato la presenza di una congruenza, seppure imperfetta, tra ospiti e simbionti.