I nucleosidi e i nucleotidi purinici sono ampiamente coinvolti nella regolazione delle funzioni intestinali. ATP e adenosina, rilasciati dalle terminazioni nervose enteriche o dal muscolo liscio, esercitano le loro azioni legandosi a specifici recettori di membrana. Pertanto le concentrazioni extracellulari delle purine, che dipendono dall'azione degli enzimi preposti alla loro formazione ed eliminazione, sono determinanti ai fini dell'effetto. Vista l'importanza dell'azione regolatrice degli adenin nucleotidi e nucleosidi nei processi infiammatori, anche a carico dell'apparato gastrointestinale, si è voluto valutare quali siano i processi maggiormente coinvolti nella produzione e eliminazione di questi metaboliti. Inoltre, si è voluto verificare se produzione ed eliminazione dipendano anche dalla presenza di forme enzimatiche solubili rilasciate dal tessuto nel liquido di incubazione, viste le riconosciute azioni protettive degli enzimi stessi. Il modello sperimentale utilizzato è stato l'ileo di ratto, di cui è stata presa la porzione distale e ne sono state ricavate delle strips. Gli esperimenti sono stati condotti in due condizioni differenti: in medium contenente strips di ileo (medium normale) e in medium dove il tessuto è stato incubato e successivamente rimosso (medium condizionato). In entrambi i casi il tessuto è stato utilizzato sia integro che privato dello strato epiteliale. Dopo l'aggiunta di adenosina o nucleotidi esogeni, le loro concentrazioni nel mezzo di incubazione sono state monitorate con metodo HPLC, assieme a quelle dei loro metaboliti. Inizialmente è stata studiata l'eliminazione dell'adenosina esogena, che è scomparsa molto rapidamente dal medium. NBTI, inibitore dei trasportatori di tipo equilibrativo per l'adenosina, non ha modificato tale scomparsa. Questo, assieme all'assenza di variazioni del nucleoside nel tessuto, porta ad escludere che l'adenosina venga captata dal tessuto stesso. Inoltre EHNA, inibitore dell'adenosina deaminasi, ha permesso un recupero totale dell'adenosina e una contemporanea abolizione della comparsa dei suoi prodotti di degradazione, dando prova del fatto che l'eliminazione avviene prevalentemente per via metabolica. In maniera analoga è stata monitorata la scomparsa di AMP, precursore diretto dell'adenosina, cAMP e ATP, entrambi fonte di AMP. In tutti i casi si è dimostrata una degradazione dei nucleotidi indice della presenza nell'ileo di ratto di ecto-enzimi: ecto-ADA, ecto-5'-Nu, ecto-cAMP-PDE ed ecto-ATPasi. Anche quando gli esperimenti sono stati condotti in medium condizionato si è osservata un'eliminazione metabolica dei nucleotidi, suggerendo la presenza di forme enzimatiche rilasciate dal tessuto nel liquido di incubazione (exo-enzimi), ma non si è ottenuta prova di una forma di una exo-PDE capace di degradare il cAMP. Infine si è valutato un eventuale coinvolgimento dello strato mucoso nell'eliminazione dell'AMP e si è approfondito lo studio della cinetica dell'ATP. La distribuzione degli enzimi degradativi e un loro eventuale rilascio nel medium sono influenzati dallo strato epiteliale. In particolare la ecto-5'-Nu è maggiormente presente negli strati muscolari e la mucosa costituisce un ostacolo al suo rilascio. Al contrario, esaminando la scomparsa dei suoi prodotti di degradazione, si nota come l'ADA sia maggiormente presente sulla mucosa, che è anche la sede preferenziale di rilascio. Dagli studi sull'eliminazione dell'ATP emerge anche che gli ecto-enzimi responsabili della sua eliminazione non sono quelli inibiti dalla suramina. L'aver caratterizzato le vie metaboliche responsabili dell'eliminazione e formazione extracellulare dell'adenosina e dei nucleotidi adeninici può contribuire allo sviluppo di terapie innovative in grado di modulare i livelli di questi autacoidi tramite un'azione sugli ecto- ed exo-enzimi coinvolti nel loro metabolismo. Questo permetterebbe di evitare l'uso di agonisti e antagonisti recettoriali, che spesso sono dotati di scarsa selettività e di elevata tossicità intrinseca.
Metabolismo di nucleosidi e nucleotidi adeninici in vitro nell'ileo di ratto
CALLIGARO, GIULIA
2009
Abstract
I nucleosidi e i nucleotidi purinici sono ampiamente coinvolti nella regolazione delle funzioni intestinali. ATP e adenosina, rilasciati dalle terminazioni nervose enteriche o dal muscolo liscio, esercitano le loro azioni legandosi a specifici recettori di membrana. Pertanto le concentrazioni extracellulari delle purine, che dipendono dall'azione degli enzimi preposti alla loro formazione ed eliminazione, sono determinanti ai fini dell'effetto. Vista l'importanza dell'azione regolatrice degli adenin nucleotidi e nucleosidi nei processi infiammatori, anche a carico dell'apparato gastrointestinale, si è voluto valutare quali siano i processi maggiormente coinvolti nella produzione e eliminazione di questi metaboliti. Inoltre, si è voluto verificare se produzione ed eliminazione dipendano anche dalla presenza di forme enzimatiche solubili rilasciate dal tessuto nel liquido di incubazione, viste le riconosciute azioni protettive degli enzimi stessi. Il modello sperimentale utilizzato è stato l'ileo di ratto, di cui è stata presa la porzione distale e ne sono state ricavate delle strips. Gli esperimenti sono stati condotti in due condizioni differenti: in medium contenente strips di ileo (medium normale) e in medium dove il tessuto è stato incubato e successivamente rimosso (medium condizionato). In entrambi i casi il tessuto è stato utilizzato sia integro che privato dello strato epiteliale. Dopo l'aggiunta di adenosina o nucleotidi esogeni, le loro concentrazioni nel mezzo di incubazione sono state monitorate con metodo HPLC, assieme a quelle dei loro metaboliti. Inizialmente è stata studiata l'eliminazione dell'adenosina esogena, che è scomparsa molto rapidamente dal medium. NBTI, inibitore dei trasportatori di tipo equilibrativo per l'adenosina, non ha modificato tale scomparsa. Questo, assieme all'assenza di variazioni del nucleoside nel tessuto, porta ad escludere che l'adenosina venga captata dal tessuto stesso. Inoltre EHNA, inibitore dell'adenosina deaminasi, ha permesso un recupero totale dell'adenosina e una contemporanea abolizione della comparsa dei suoi prodotti di degradazione, dando prova del fatto che l'eliminazione avviene prevalentemente per via metabolica. In maniera analoga è stata monitorata la scomparsa di AMP, precursore diretto dell'adenosina, cAMP e ATP, entrambi fonte di AMP. In tutti i casi si è dimostrata una degradazione dei nucleotidi indice della presenza nell'ileo di ratto di ecto-enzimi: ecto-ADA, ecto-5'-Nu, ecto-cAMP-PDE ed ecto-ATPasi. Anche quando gli esperimenti sono stati condotti in medium condizionato si è osservata un'eliminazione metabolica dei nucleotidi, suggerendo la presenza di forme enzimatiche rilasciate dal tessuto nel liquido di incubazione (exo-enzimi), ma non si è ottenuta prova di una forma di una exo-PDE capace di degradare il cAMP. Infine si è valutato un eventuale coinvolgimento dello strato mucoso nell'eliminazione dell'AMP e si è approfondito lo studio della cinetica dell'ATP. La distribuzione degli enzimi degradativi e un loro eventuale rilascio nel medium sono influenzati dallo strato epiteliale. In particolare la ecto-5'-Nu è maggiormente presente negli strati muscolari e la mucosa costituisce un ostacolo al suo rilascio. Al contrario, esaminando la scomparsa dei suoi prodotti di degradazione, si nota come l'ADA sia maggiormente presente sulla mucosa, che è anche la sede preferenziale di rilascio. Dagli studi sull'eliminazione dell'ATP emerge anche che gli ecto-enzimi responsabili della sua eliminazione non sono quelli inibiti dalla suramina. L'aver caratterizzato le vie metaboliche responsabili dell'eliminazione e formazione extracellulare dell'adenosina e dei nucleotidi adeninici può contribuire allo sviluppo di terapie innovative in grado di modulare i livelli di questi autacoidi tramite un'azione sugli ecto- ed exo-enzimi coinvolti nel loro metabolismo. Questo permetterebbe di evitare l'uso di agonisti e antagonisti recettoriali, che spesso sono dotati di scarsa selettività e di elevata tossicità intrinseca.File | Dimensione | Formato | |
---|---|---|---|
CalligaroGiulia_tesiDOTTORATO.pdf
accesso aperto
Dimensione
727.57 kB
Formato
Adobe PDF
|
727.57 kB | Adobe PDF | Visualizza/Apri |
I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14242/107431
URN:NBN:IT:UNIPD-107431