Development of novel helical nucleopeptides for applications as nucleic acid modulators

Riassunto La terapia genica mira a curare determinate malattie operando a livello molecolare sugli acidi nucleici (DNA et RNA). Oligonucleotidi sintetici possono riconoscere selettivamente sequenze complementari ed inibire o modulare l’espressione genica in vitro. Non è tuttavia possible utilizzare oligonucleotidi sintetici per applicazioni in vivo, a causa di svariati gravi problemi, in particolare la loro rapida degradazione enzimatica e la grande difficoltà di penetrazione attraverso le membrane cellulari. Per superare tali limiti sono stati proposti analoghi di nucleotidi, che dovrebbero possedere migliori proprietà biologiche, mantenendo, o perfino migliorando, l’affinità e la selettività verso sequenze complementari caratteristiche delle strutture nucleotidiche naturali. Una tra le classi di analoghi sviluppate di recente sono i nucleopeptidi, peptidi contenenti nucleoamminoacidi, ossia amminoacidi non proteogenici che portano una nucleobase in catena laterale. Il presente lavoro di tesi aveva l’obiettivo di studiare le proprietà di nucleopeptidi sequenziali in conformazione elicoidale contenenti alanil-nucleoamminoacidi (AlaB) in posizione i,i+3 per applicazioni come modulatori di acidi nucleici. Infatti, se tali nucleopeptidi assumono una conformazione elicoidale 310, le nucleobasi in catena laterale si trovano allineate lungo l’elica e ciò potrebbe favorire interazioni cooperative con sequenze complementari. Per meglio valutare l’importanza della strutturazione sulle proprietà di riconoscimento dei nucleopeptidi, si sono sintetizzati sia nucleopeptidi rigidi (basati sull’amminoacido C?-tetrasostituito Aib, che favorisce l’assunzione di strutture elicoidali 310), sia analoghi flessibili (basati sull’amminoacido proteogenico Ala, meno strutturante), e ne sono state studiate sia le proprietà conformazionali che biologiche. Riguardo ai nucleopeptidi rigidi sono descritte: (I) La sintesi e la caratterizzazione di nucleopeptidi protetti contententi ciascuno una delle quattro nucleobasi del DNA; (II) La sintesi e la caratterizzazione di un nucleoesapeptide protetto e di un nucleoeptapeptide idrosolubile completamente deprotetto, entrambi contenenti due timine; (III) La struttura cristallina di un nucleotripeptide protetto contenente timina; (IV) La caratterizzazione conformazionale in soluzione dei nucleotripeptidi protetti, del nucleoesapeptide e del nucleoeptapeptide. Riguardo ai nucleopeptidi flessibili sono descritte: (I) La progettazione e la sintesi in parallelo su fase solida di librerie di nucleopeptidi modello per l’ottimizzazione dei protocolli sintetici e per analisi conformazionali; (II) La progettazione e la sintesi in parallelo su fase solida di librerie di nucleopeptidi contenenti ciascuna delle quattro nucleobasi del DNA, parzialmente biotinilati o derivatizzati con fluorofori, per studi di riconoscimento e biologici; (III) La caratterizzazione conformazionale CD e 2D NMR di un nucleoeptapeptide modello contenente due timine e di un analogo con un residuo di Aib al centro della sequenza; (IV) L’analisi per risonanza plasmonica di superficie delle proprietà di riconoscimento tra nucleopeptidi e tra nucleopeptidi e nucleotidi via immobilizzazione di molecole biotinilate su lastrine di oro funzionalizzate. Riguardo alla valutazione delle proprietà biologiche dei nucleopeptidi, sono descritti: (I) Test di citotossicità svolti su un nucleopeptide rigido e su vari nucleopeptidi flessibili basati sulla timina; (II) Misure di citometria in flusso ed analisi di microscopia riguardo alle proprietà di penetrazione cellulare di nucleopeptidi fluorescenti o biotinilati basati sulla timina, supportate da prove di colocalizzazione e da un’analisi della dipendenza da tempo, concentrazione ed energia della penetrazione cellulare; (III) Misure di stabilità in siero murino eseguite sugli eptapeptidi rigido, misto e flessibile contenenti timina. Infine l’insieme dei dati raccolti è stato valutato nella sua totalità onde fornire un giudizio globale sulle proprietà dei nucleopeptidi studiati per lo sviluppo di modulatori di acidi nucleici.