Identificazione di geni differenzialmente espressi nella distrofia muscolare di Duchenne e loro ruolo nella progressione di malattia

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e’ una malattia neuromuscolare dell’eta’ infantile invariabilmente letale caratterizzata da un deficit di forza progressivo. L’esordio della debolezza muscolare e’ usualmente verso i 3-5 anni e progredisce fino alla perdita della deambulazione in media intorno ai 10 anni e mezzo. L’exitus, nella seconda-terza decade, e’ dovuta alla comparsa di insufficienza respiratoria e/o cardiaca. La sola terapia palliativa efficace nel rallentare la progressione di malattia e’ la terapia steroidea. La somministrazione di steroidi nella DMD risulta nel prolungamento della deambulazione di circa 18 mesi nei pazienti trattati rispetto ai non trattati. Tuttavia l’eta’ alla perdita della deambulazione presenta una ampia deviazione standard dovuta alla presenza sia di pazienti che perdono la deambulazione molto precocemente ed altri molto tardivamente sia nei pazienti trattati che non trattati. Le basi molecolari di questa variabilita’ fenotipica non sono. Nel tentativo di identificare i fattori modulanti favorevolmente il fenotipo clinico, abbiamo studiato 8 pazienti con diagnosi molecolare di DMD. Tutti i pazienti erano stati trattati con steroidi a dosaggio standard fino alla perdita della deambulazione. I pazienti sono stati arbitrariamente classificati come responsivi (R) (n=5) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta dopo i 13 anni e non-responsivi (NR) (n=3) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta prima dei 10 anni di età. Allo scopo di identificare gruppi di trascritti genici differenzialmente espressi tra i due gruppi di pazienti è stata eseguita un’analisi dei profili d’espressione (Microarray) utilizzando una piattaforma di oligonucleotidi genome-wide (Operon), seguita da un’elaborazione statistica dei dati. Una volta identificati i geni regolati in modo differenziale, lo studio ha mirato all’identificazione di un sottogruppo di geni differenzialmente espressi nei pazienti R e NR. Con tale criterio sono stati individuati nel pool dei pazienti R 47 geni significativamente deregolati rispetto ai pazienti NR: 37 geni sovraespressi, molti dei quali codificanti per fattori di trascrizione, e 10 geni sottoespressi, tra cui geni strutturali normalmente espressi durante lo sviluppo, geni coinvolti nella risposta immunologica e altri che codificano per proteine presenti nella matrice extracellulare. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati sottoposti ad analisi funzionale allo scopo di individuare cascate biochimiche in cui essi fossero coinvolti. Valutando l’interazione tra i geni identificati, sono risultati particolarmente significativi la cascata di signaling dell’interferone (IFN) e la cascata di trasduzione del segnale del Fattore Nucleare kappa B (NF-kB), un fattore di trascrizione ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti nei processi infiammatori e nella risposta acuta allo stress. Dati sperimentali suggeriscono che la regolazione dell’attività di NF-kB possa favorevolmente modulare la progressione della distrofia muscolare nel modello animale di DMD (topo mdx). Almeno 4 tra i geni considerati (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) hanno un ruolo nel processo di attivazione di NF-kappaB. Al fine di validare la significativa sovraespressione di questi trascritti nel pool di pazienti “steroido-responsivi” rispetto al pool di pazienti “steroido non-responsivi”, sono stati condotti degli esperimenti di Real Time-PCR. Dall’analisi è emersa una variabilità all’interno dei singoli gruppi. Per ovviare a tale problema, una seconda analisi statistica dei dati è stata eseguita confrontando singolarmente ogni paziente con un controllo scelto in base all’età alla perdita della deambulazione. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati valutati in base alle loro caratteristiche di funzione, espressione fisiologica ed interazioni. In questa seconda analisi, si è evidenziato in particolare un coinvolgimento di alcuni membri della superfamiglia del TNF (TNF, TNFS10, LTA, LTB) ed un gene codificante per un putativo inibitore di NF-kappaB (NFKBIL1). Sono stati presi in considerazione anche altri 5 geni (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2), selezionati perché la loro espressione risultava uniforme all’interno dei due gruppi di pazienti, così da poter eliminare la variabilità intergruppo. Anche in questo caso i dati sono stati necessariamente validati con esperimenti di Real Time-PCR. Il gene che, superato il controllo di validazione, è risultato significativo è USMG5 (Up-regulated during the skeletal muscle growth 5), successivamente studiato allo scopo di identificare polimorfismi di singolo nucleotide (SNP). È stata valutata l’esistenza di SNP noti, consultando il database di SNP, nel gene USMG5 ed in altri 2 geni scelti dalla letteratura: ACTN3 che codifica per la proteina alpha-actinina 3, espressa esclusivamente nel disco Z delle fibre di tipo II del muscolo scheletrico, e AKT1 che codifica per la serina-treonina protein chinase, coinvolta nella trasduzione del segnale dei fattori di crescita come IGF1, oltre ad avere un ruolo nello sviluppo e nella sopravvivenza cellulare e nell’attivare NF-kB. I pazienti sono stati analizzati per il polimorfismo R577X nel gene ACTN3, +G205T nel gene AKT1 e S49P nel gene USMG5. La distribuzione genotipica è stata messa a confronto con la forza muscolare, ma i test non hanno evidenziato differenze statisticamente significative. In conclusione, il nostro studio dei profili di espressione nei pazienti affetti da DMD ha dimostrato la possibilita’ di clusterizzare a priori pazienti con progressione clinica diversa. Questo risultato e’ rilevante considerando che implica la possibilita’ che alla base della progressione di malattia nella DMD vi sia una regolazione genica differenziale. Questo dato offre strategie terapeutiche alternative alla sola correzione del difetto genico con terapia genica o cellulare. Ulteriori studi sono necessari per definire meglio i meccanismi molecolari alla base della modulazione del fenotipo nella DMD.