Establishiment of Canine RNA polymerase I-Promoter driven Reverse Genetics for Influenza A virus

Reverse Genetics I vaccini per l’influenza, vivi e uccisi, sono efficaci nel prevenire e tenere sotto controllo il diffondersi della malattia, ma le variazioni antigeniche che caraterizzano le glicoproteine emmaglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) del virus dell’influenza A, richiedono frequenti cambi nella loro formulazione. Le nuove tecnologie come la Reverse Genetics (RG), attraverso la quale è possible recuperare il virus infettivo da cellule trasfettate con DNA plasmidico che codifica gli 8 segmenti del genoma virale, potrebbero essere utili per accorciare i tempi di ottenimento del “seme virale” per la preparazione dei vaccini. Infatti, la RG può permettere di ottenere rapidamente riassortanti con ottime caratteristiche di crescita in uova o cellule MDCK (cellule renali di cane) attraverso la combinazione dei sei geni interni da virus ad alta produttività e HA e NA dai ceppi circolanti. Lo scopo della mia tesi è stato quello di esplorare il possibile uso di questa nuova tecnica per generare e produrre vaccini influenzali. Per fare questo, abbiamo messo a punto un sistema di Reverse Genetics in cui l’RNA polimerasi (polI) canina, permette al virus di svilupparsi in MDCK, una linea cellulare approvata dall’FDA per la produzione di vaccini influenzali e che supporta un’efficiente crescita del virus stesso. Le nostre scoperte dimostrano che il sistema di RG a 8 plasmidi consente una rapida e riproducibile generazione di riassortanti dell’influenza A da poter utlizzare nella preparazione dei vaccini. Grazie all’aiuto di questa nuova tecnologia, potremmo sviluppare rapidamente vaccini sicuri, cross protettivi tra i vari ceppi virali e che richiedono una quantità minore di virus rispetto a quelli tradizionali. Fluinnate Il virus dell’influenza A è un notevole patogeno sia per gli uomini che per diverse specie animali. Questi virus sono stati isolati sia da uccelli che da mammiferi sebbene nei primi siano in una fase di stasi dal punta di vista evolutivo. I virus che infettano gli uccelli acquatici non hanno potere contaminate sull’uomo in quanto hanno necessità di riassortarsi e adattarsi ad un ospite intermedio prima di emergere nel genere umano. Si pensa che l’impedimento della replicazione negli uomini da parte del virus aviario sia dovuto ad una non ottimale specificità di recettore di legame. Durante il singolo ciclo infettivo, il virus umano preferenzialmente infetta le cellule non ciliate, mentre quello aviario, così come la variante della forma umana adattata a crescere nelle uova che ritorna ad avere una specificità di recettore aviaria, preferenzialmente infetta le cellule ciliate. Questo presupposto è in accordo con la predominante localizzazione dei recettori per la forma umana (acidi sialici legati con un legame di tipo α2-6) sulle cellule non ciliate e dei recettori per la forma aviaria (acidi sialici legati con un legame di tipo α2-3) su quelle ciliate. Queste scoperte rafforzano l’idea che sebbene il virus dell’influenza aviaria può infettare l’epitelio del tratto respiratorio umano, la sua capacità di replicazione rimane limitata ad un tropismo cellulare non ottimale. Attraverso la RG abbiamo generato diversi virus ricombinanti che defferiscono unicamente nella loro specificità di recettore per l’HA e li abbiamo utilizzati per esaminare se quest’ultima unita all’attività sialidasica del virus può influenzare la risposta immunitaria determinandone la patogenicità. Abbiamo testato le risposte immunitarie e cellulari su colture differenziate di epitelio respiratorio umano e su cellule umane immunocompetenti isolate, scoprendo che l’iniziale risposta immunitaria innata scaturita dall’infezione da parte del virus nell’epitelio respiratorio, può essere determinata in maniera significativa dalle proprietà di legame della molecola di emmaglutinina virale.