Analisi funzionale di isoforme native e mutanti della pompa Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica

Le pompe PMCA (Plasma Membrane Ca2+-ATPases) rappresentano un sistema di importanza primaria per l’estrusione del Ca2+ dal citoplasma delle cellule eucarioti. Le pompe PMCA fanno parte di una famiglia multigenica: 4 geni codificano 4 diverse isoforme (PMCA1-4) e la diversità delle isoforme è aumentata da meccanismi di splicing alternativo dei trascritti primari che generano più di 30 isoforme diverse. L’espressione delle diverse isoforme, oltre ad essere tessuto specifica, è regolata durante lo sviluppo ed il differenziamento cellulare. Le isoforme PMCA1 e 4 hanno una distribuzione ubiquitaria, mentre le isoforme PMCA2 e 3 sono prevalentemente neuronali . Il significato funzionale di un numero così elevato di isoforme è tuttora oggetto di studio nel campo delle pompe PMCA. Opinione generale è che ognuna delle isoforme svolga un ruolo specifico a seconda delle esigenze specifiche della cellula. Si ipotizza inoltre che la localizzazione e l’attività tessuto-specifica delle diverse isoforme possa essere influenzata da interazioni isoforma-specifiche con partner proteici diversi. I risultati ottenuti nel nostro Laboratorio hanno dimostrato che una delle isoforme ubiquitarie, la pompa PMCA4, a differenza dell’isoforma tessuto-specifica PMCA2, interagisce con un partner particolarmente interessante, la proteina 14-3-3, e che questa interazione ha un effetto inibitorio sull’attività della pompa. Nella prima parte del mio Dottorato di ricerca, l’indagine della ricerca di interattori molecolari è stata estesa alle rimanenti isoforme, quella tessuto-specifica PMCA3 e quella ubiquitaria PMCA1. La ricerca è stata condotta mediante un saggio di interazione di doppio ibrido in lievito usando come “esca” la porzione N-terminale delle pompe PMCA3 e PMCA1. E’ stato riscontrato che l’altra isoforma tessuto-specifica, la pompa PMCA3, a differenza della pompa PMCA2 interagisce con la proteina 14-3-3. La pompa PMCA1 invece non interagisce. La nostra ricerca si è quindi focalizzata nell’individuare il motivo per cui la PMCA2 è l’unica isoforma tra le PMCA a non interagire con la proteina 14-3-3. Un’analisi bioinformatica della regione N-terminale delle 4 isoforme delle PMCA usata come esca nel saggio del doppio ibrido in lievito ha rivelato che in tutte e 4 le isoforme si trova una sequenza consenso per il legame delle proteine 14-3-3, ma anche che la pompa PMCA2 possiede dei residui amminoacidi nelle regioni fiancheggianti il sito di consenso che disturbano la corretta struttura secondaria necessaria alla interazione. L’ipotesi proposta dall’analisi bionformatica è stata confermata sperimentalmente. Sono state infatti costruite 2 esche per il saggio di interazione del doppio ibrido dividendo in 2 la sonda originale di 90aa nella parte N-terminale della PMCA4 che interagiva con 14-3-3. Una delle due sonde conteneva il sito consenso di interazione, ma non i siti di fiancheggianti responsabili della formazione della struttura secondaria ad ?-elica,, l’altra non conteneva il sito di interazione. Queste sonde sono state testate per loro capacità di interagire con la proteina 14-3-3 nel sistema del doppio ibrido in lievito e nessuna delle due ha dato risultati positivi. Una terza sonda, più corta della esca originale di 90 aa ma che conteneva sia il sito di consenso che le regioni fiancheggianti ha dato invece risultati positivi, confermando così che sia il sito di consenso che le regioni fiancheggianti sono necessarie all’interazione e che la non interazione non dipende dalla lunghezza ridotta delle sonde. Gli studi successivi nel corso del mio dottorato di ricerca si sono quindi concentrati a caratterizzare funzionalmente la pompa PMCA2. Questa isoforma è particolarmente interessante in quanto possiede alcune proprietà che la distinguono dalle altre isoforme. E’ inoltre l’unica isoforma per la quale sono state descritte mutazioni puntiformi del gene responsabili di un fenotipo patologico: topi che presentano mutazioni spontanee del gene della PMCA2 presentano un fenotipo associato a sordità e a difetti di equilibrio e coordinazione. Nella seconda parte della tesi sono presentati i dati ottenuti della caratterizzazione funzionale delle diverse varianti di splicing della pompa PMCA2. Le pompe sono state sovraespresse in un sistema cellulare omogeneo ed è stata misurata la loro capacità di contrastare l’aumento transiente della concentrazione di Ca2+ citosolico indotto da uno stimolo fisiologico. Successivamente è anche stata caratterizzata l’attività di alcune forme mutanti della PMCA2 individuate nel topo e nell’uomo. I plasmidi di espressione per le varianti di splicing della PMCA2 w/a, w/b, z/a e z/b sono stati co-transfettati con un plasmide per l’espressione di una sonda per il Ca2+, la fotoproteina ricombinante Ca2+-sensible equorina (cytAEQ), in una linea stabile di cellule di ovario di criceto (CHO). Le cellule CHO sono state stimolate con ATP, un agonista fisiologico che agisce sui recettori purinergici P2Y accoppiati a proteine G e genera, in seguito alla produzione del secondo messaggero inositolo 1,4,5 trifosfato (che apre i canali per il Ca2+ dei depositi intracellulari) un aumento transiente della concentrazione di Ca2+ citosolico. E’ stato osservato che le isoforme z/b, z/a e w/b sono particolarmente efficaci nel ridurre l’altezza del picco del transiente di Ca2+ (lo riducono infatti del 50%), caratteristica che riflette la capacità della pompa di rispondere con una rapida attivazione all’aumento improvviso della concentrazione di Ca2+. La variante w/a invece sembra avere una minore capacità di controllare il picco di Ca2+, lo riduce infatti solo del 30% rispetto alle cellule di controllo. La PMCA2w/a quindi risponde meno efficientemente ad un aumento improvviso della concentrazione di Ca2+ citoplasmatica. Questa caratteristica potrebbe giustificare l’esclusiva presenza della variante w/a della PMCA2 nelle stereocilia delle cellule sensoriali dell’orecchio interno. Infatti la concentrazione di Ca2+ extracellulare nell’endolinfa, il liquido che bagna le stereocilia, è notevolmente più bassa di quella degli altri ambienti extracellulari essendo dell’ordine di 10-20 ?M anziche mM. La caratterizzazione delle pompe mutate responsabili di fenotipo di sordità nel topo (3 mutanti) e nell’uomo (un mutante) ha dimostrato che le mutazioni non modificano le capacità della pompa di contrastare l’altezza del picco del transiente di Ca2+ generato dalla stimolazione cellulare, ma riducono invece la sua velocità nel ripristinare i livelli basali: colpiscono cioè la fase discendente del transiente di Ca2+. I livelli basali di Ca2+ vengono quindi ripristinati più lentamente e ciò determina che nelle cellule che presentano le PMCA2 mutate la concentrazione di Ca2+ citosolica resta elevata per tempi più lunghi rispetto alla situazione che si verifica nelle cellule di controllo. I dati dimostrano quindi che le mutazioni della PMCA2 non influiscono sulla capacità della pompa a rispondere ad un arrivo repentino di Ca2+, ma invece alterano l’attività basale della pompa. Queste alterazioni dell’omeostasi del Ca2+ a livello delle cellule sensoriali dell’orecchio interno si ripercuotono probabilmente sul fenomeno dell’adattamento rendendo le cellule “meno pronte” a ricevere stimoli sonori successivi portando così ad un fenotipo di sordità.