Studi biochimici e funzionali di due [FeFe]-idrogenasi

Le idrogenasi, una famiglia di metallo enzimi che catalizzano la produzione di idrogeno molecolare (H2) da protoni ed elettroni secondo l'equazione 2H+ + 2e- ? H2, sembrano essere molto promettenti in termini di bioproduzione di idrogeno come processo per l’ottenimento di energia pulita e rinnovabile. In questo contesto, tuttavia, esistono due limiti molto importanti che ostacolano lo sviluppo di applicazioni biotecnologiche per la bioproduzione di idrogeno su larga scala: i) una bassa efficienza di conversione, in termini di energia impiegata per l’ottenimento di idrogeno molecolare e ii) una severa inibizione, in molti casi irreversibile, da parte dell’ossigeno molecolare, che impone un ambiente strettamente anaerobico per la produzione di idrogeno. Tali limiti possono essere superati chiarendo a livello molecolare i meccanismi alla base sia della catalisi enzimatica che porta alla produzione di idrogeno che dell’inibizione di questi enzimi da parte dell’ossigeno, non ancora del tutto compresi. Il mio lavoro di dottorato è stato focalizzato sullo studio biochimico e funzionale di due [FeFe]-idrogenasi, gli enzimi di Enterobacter cloacae e di Thermotoga neapolitana. In particolare, nella prima parte del lavoro mi sono occupata dell’espressione dell’enzima di E. cloacae nel sistema eterologo E. coli e della sua parziale caratterizzazione biochimica e funzionale; tale enzima, che era stata proposta come la più piccola idrogenasi ad oggi isolata, poteva infatti offrire un ottimo modello per lo studio dell’organizzazione molecolare e funzionale di [FeFe]-idrogenasi più complesse. Tuttavia, i dati ottenuti da diverse studi biochimici, tra cui analisi del sito attivo mediante EPR e verifica dell’attività idrogenasica, portano a concludere che non esiste alcuna evidenza strutturale e funzionale che la proteina ricombinante di E. cloacae sua effettivamente una [FeFe]-idrogenasi e confermano il diffuso scetticismo della comunità scientifica intorno a questo enzima. La seconda parte del lavoro è stata dedicata allo studio della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana, un enzima trimerico molto cmplesso che non è mai stato isolato e caratterizzato. Il batterio ipertermofilico T. neapolitana è capace di produrre idrogeno anche in presenza di micro-concentrazioni di ossigeno molecolare; pertanto, la sua idrogenasi potrebbe rappresentare un buon modello per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensibilità all’ossigeno di questa classe di enzimi. L’espressione della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana in E. coli in forma funzionale ha consentito di ottenere un sistema di studio utile per approfondire la diversa sensibilità di tale proteina all’ossigeno. Con questo sistema sarà possibile valutare in vitro la massima percentuale di ossigeno compatibile con la sua attività catalitica e condurre un approccio di mutagenesi sito-specifica volta a comprendere il meccanismo molecolare alla base dell’inibizione. L’ultima parte del mio lavoro è stata focalizzata sull’analisi strutturale della proteina HydF di T. neapolitana, coinvolta nel complesso meccanismo di maturazione della [FeFe]-idrogenasi, ancora oggi largamente sconosciuto. In particolare, tutte le [FeFe]-idrogenasi presentano un sito attivo complesso ed insolito e necessitano pertanto di diverse proteine per la loro maturazione; tre di queste maturasi, denominate HydE, HydF, ed HydG, precedentemente identificate e riscontrate in tutti gli organismi contenenti [FeFe]-idrogenasi, sembrano essere necessarie e sufficienti per l’ottenimento di un enzima attivo. L’espressione eterologa della proteina di maturazione HydF di T. neapolitana in E. coli ha evidenziato per la prima volta che la proteina in soluzione si presenta come oligomero, in forma dimerica e tetramerica. Sono stati ottenuti diversi cristalli della proteina, la cui analisi mediante diffrazione a raggi X potrà fornire numerose informazioni sul suo meccanismo d’azione nel folding delle[FeFe]-idrogenasi, un soggetto di ricerca che sta ricevendo oggi una crescente attenzione