Espressione omologa ed eterologa della [FeFe ]-idrogenasi di Chlamydomonas reinhardtii

Le idrogenasi, enzimi chiave nel metabolismo dell’idrogeno di molti microrganismi, sono considerate una possibile futura fonte di energia. In particolare, la capacità dell’alga verde C. reinhardtii di ridurre protoni e rilasciare idrogeno gassoso dopo illuminazione per mezzo di una [FeFe]-idrogenasi rappresenta un fenomeno di grande interesse scientifico, poiché permetterebbe di ottenere energia dalle due risorse naturali più diffuse: acqua ed energia solare. Tuttavia, l’attività catalitica è fortemente ed irreversibilmente inibita dall’ossigeno prodotto durante la fotosintesi; inoltre, l’idrogenasi algale è espressa a livelli molto bassi e solo in stretta anaerobiosi. Questa natura mutualmente esclusiva della fotoproduzione di idrogeno ed ossigeno rappresenta un importante ostacolo nello sviluppo della produzione biotecnologica di idrogeno. Lo studio della relazione struttura-fuzione della [FeFe]-idrogenasi, che permetterebbe di chiarire i meccanismi molecolari alla base della produzione di H2 e della sesibilità all’O2, richiede la caratterizzazione della proteina nativa e modificata. La struttura 3D della [FeFe]-idrogenasi di C. reinhardtii non è ancora stata ottenuta, principalmente perché le quantità di proteina purificata direttamente dall’alga sono molto basse. Quindi, ho sovraespresso tale enzima in un sistema omologo ed in uno eterologo per ottenere una quantità di proteina sufficiente per condurre studi biochimici. Il cianobatterio Synechococcus PCC 7942, che possiede una [NiFe]-idrogenasi, è in grado di sintetizzare la [FeFe]-idrogenasi di C. pasteurianum in forma attiva, suggerendo che il sistema di maturazione dei cianobatteri sia suffientemente flessibile da permettere la biosintesi di una [FeFe]-idrogenasi funzionale. Nel corso del dottorato ho ottenuto due costrutti per trasformare il cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 e permettere l’espressione della [FeFe]-idrogenasi algale. I ceppi ricombinanti esprimenti l’enzima di C. reinhardtii sono in grado produrre idrogeno in quantità da 4 a 5 volte superiori rispetto al ceppo wild type (che ha solo una [NiFe]-idrogenasi). Questi dati aprono nuove prospettive circa l’indispensabile presenza delle proteine accessorie HydE, HydF e HydG per ottenere una [FeFe]-idrogenasi correttamente ripiegata. Contemporaneamente, ho condotto l’espressione omologa dell’enzima direttamente in C. reinhardtii. Dal momento che importanti limiti di questo sistema sono dati dal basso quantitativo di proteina espressa e dall’instabilità del ceppo mutante dell’alga, sto attualmente mettendo a punto nuove strategie per risolvere questi problemi. Inoltre, saranno condotte delle mutagenesi sito-specifiche per chiarire i meccanismi catalitici e migliorare la produttività dell’enzima