Molecular Characterization of Mitochondria Interactions with other Organelels

In questa tesi di dottorato, è stata condotta un’analisi degli organelli in cellule vegetali, studiando, in particolare, i mitocondri e la loro morfologia in diverse condizioni fisiologiche. La regolazione della morfologia mitocondriale è importante sotto molteplici aspetti, infatti controlla il numero dei mitocondri durante la divisione cellulare e la loro distribuzione all’interno di ogni cellula (Wastermann, 2010; Logan, 2003), controlla infine alcune funzioni biologiche. Nelle cellule animali, per esempio, la frammentazione dei mitocondri è un evento precoce che caratterizza il processo di apoptosi (Suen et al., 2008). Un’associazione tra morfologia mitocondriale e senescenza/morte cellulare programmata (PCD) è stata riportata anche in colture cellulare vegetali (Zottini et al., 2006). La comprensione dei meccanismi molecolari, utilizzati dalla pianta per regolare il processo di senescenza/PCD, può essere importante da un punto di vista biotecnologico, in quanto potrebbe permettere una modulazione dei parametri di crescita e di sviluppo della pianta attraverso miglioramenti genetici e manipolazioni di fattori ambientali che regolano il processo di senescenza. I risvolti applicativi di tale approcio sono molto interessanti, soprattutto per le specie di rilevanza agronomica. Alla luce di tali premesse, la morfologia mitocondriale è stata dettagliatamente analizzata durante il processo di senescenza/PCD in vite (Vitis spp). La vite rapprensenta una delle più importanti piante coltivate della zona del Mediterraneo, ed a seguito del sequenziamento del suo genoma (Jaillon et al., 2007; Velasco et al., 2007), è ritenuta un organismo modello negli studi sugli alberi da frutto. Inizialmente l’analisi della morfologia mitocondriale durante il processo di senescenza/morte cellulare programmata è stata condotta in colture cellulari di Vitis spp.. In seguito, lo studio è stato continuato in pianta, in particolare è stata portata avanti un’analisi dettagliata della morfologia mitocondriale durante i differenti stadi di sviluppo e di senescenza della foglia. A tal fine, sono state prodotte ed analizzate piante transgeniche, esprimenti un marcatore fluorescente mitocondriale. Le analisi condotte hanno dimostrato che in foglie senescenti i mitocondri presentano delle morfologie caratteristiche. Questi risultati ci hanno indirizzato ad uno studio degli aspetti molecolari coinvolti nella regolazione della morfologia mitocondriale. In numerose cellule eucariotiche, la morfologia mitocondriale è regolata dal continuo alternarsi di eventi di fusione e fissione mitocondriale (Logan, 2003). Nelle piante, i componenti molecolari coinvolti nel meccanismo di fusione mitocondriale non sono stati ancora individuati, mentre i componenti proteici implicati nella fissione sono stati recentemente descritti in Arabidopsis. A tuttoggi non è stato ancora compreso nè il preciso ruolo svolto da tali proteine, nè le loro precise interazioni fisiche, responsabili del processo di fissione mitocondriale. Durante il mio dottorato, ho quindi analizzato, nel sistema modello Arabidopsis thaliana, la localizzazione subcellulare, l’espressione e l’interazione di due proteine (ELM1 ed BIGYIN), coinvolte nel processo di divisione mitocondriale. La localizzazione subcellulare di ELM1 e BIGYIN è stata determinata in cellule vegetali, utilizzando differenti metodi di espressione transiente combinati con analisi di microscopia confocale. Sono state poi eseguite analisi per verificare l’interazione di queste due proteine in vivo in cellule vegetali. Successivamente è stata condotta in pianta un’analisi del pattern di espressione di BIGYIN ed ELM1, in modo tale da verificarne l’espressione di queste due proteine negli stessi tessuti, prerequisito fondamentale per una loro eventuale interazione. A tal fine, sono state prodotte ed analizzate mediante saggio istochimico-colorimetrico piante transgeniche di Arabidopsis thaliana stabilmente esprimenti il promotore di tali geni fuso al gene che codifica per l’enzima -glucuronidasi (GUS). Per definire il ruolo fisiologico di BIGYIN, una dettagliata localizzazione subcellulare di questa proteina è stata eseguita in piante di Arabidopsis, stabilmente esprimenti il costrutto YFP::BIGYIN sotto il controllo del proprio promotore. Queste analisi hanno messa in evidenza un’associazione tra BIGYIN e cloroplasti/plastidi ed ha portato ad individuare particolari protrusioni, marcate con la proteina di fusione YFP::BIGYIN, che si estondono dai cloroplasti, mitocondri e perossisomi. Protrusioni simili erano già state riportate in letteratura e prendono il nome di ‘stromuli’, ‘matrixuli’, ‘peroxuli’ a seconda che si estendano rispettivamente da cloroplasti, mitocondri o perossisomi. Recentemente, è stato ipotizzato che tali le protrusioni abbiano un ruolo nelle interazioni fisiche tra i differenti organelli, aumentando i contatti fisici tra gli organuli e migliorando l’efficienza di scambio di metaboliti/molecule (Scott et al., 2007). Tuttavia nessun dato è stato riportato a conferma di tale ipotesi. L’inattesa presenza di BIGYIN su tali protrusioni, ci ha permesso di studiare in dettaglio la loro dinamicità e di analizzare la presenza di interazioni fisiche tra gli organelli. La comprensione delle interazioni fisiche tra gli organelli si colloca nel campo di indagine delle relazioni tra tali compartimenti subcellulari che viene ora considerato un campo fondamentale per la conoscenza dei meccanismi di base della biologia cellulare vegetale.