Development and Application of New Strategies for Genome Scaffolding and Gene Predictio applied to NGS data

La commercializzazione delle nuove tecnologie di sequenziamento (NGS, Next Generation Sequencing), ha avuto un grande impatto sia a livello economico sia biologico, grazie alla significativa riduzione dei tempri di produzione e dei costi, e all’aumento della quantità di dati ottenuti. Le nuove tecniche di sequenziamento hanno permesso di ricreare il genoma di migliaia di organismi, sia piccoli come i microbi, sia grandi come il genoma umano, aprendo nuove aree di ricerca. Ad esempio, ora è possibile studiare il DNA antico, fare ricerca su malattie genetiche, studiare caratteristiche e differenze evolutive tra organismi,... I nuovi metodi si possono applicare a tre campi principali: genomico (come l’assemblaggio dei genomi, la ricerca di SNPs e variazioni strutturali), trascrittomico (per eseguire la predizione genica, l’annotazione e lo studio di splicing alternativi) ed epigenetico. I sequenziatori di nuova generazione hanno apportato cambiamenti anche a livello bioinformatico. Infatti, con l’acquisizione di moli di dati sempre più grandi, si è reso necessario affrontare il problema della loro gestione dal punto di vista sia di tempo computazionale per analizzarli sia di memoria richiesta per immagazzinarli. Inoltre, si è resa necessaria l’implementazione di strumenti in grado di elaborare i dati grezzi ottenuti, per trasformali in utili informazioni da applicare nelle analisi biologiche. Attualmente le tre piattaforme di sequenziamento più utilizzate sono Roche/454 , Illumina/Solexa Genome Analyzer, e Applied Biosystems SOLiDTM. Il primo sequenziatore ad essere commercializzato nel 2005 fu il 454. Si basa su tecniche di sequenziamento innovative (pyrosequencing) ed è in grado di produrre sequenze lunghe 300-400 basi, con una buona qualità media. Tuttavia il 454 non raggiunge i livelli di produzione di altri sequenziatori, come SOLiD ed Illumina, che in poco tempo sono in grado di produrre milioni di sequenze, anche se di dimensioni minori (circa 50 e 70 basi rispettivamente per SOLiD e Illumina). L’idea del mio dottorato è di applicare le conoscenze matematiche ed informatiche allo studio di nuove tecniche per l’utilizzo dei dati di nuova generazione in problemi biologici. Lo scopo è di sviluppare dei programmi in grado di elaborare grandi quantità di dati in poco tempo. Con la mia ricerca ho collaborato all’implementazione di metodi per la risoluzione di problemi di assemblaggio e di predizione genica. Il sequenziamento de novo e successivamente l’assemblaggio sono un punto fondamentale per l’analisi del genoma di un organismo. Attualmente il problema dell’assemblaggio è un problema ancora aperto e ampiamente studiato: non esistono ancora programmi in grado di ricostruire un genoma completo partendo da reads prodotte con un sequenziamento di nuova generazione. Esistono software come Newbler, Velvet e Cabog che producono lunghi frammenti di sequenza (contigs), ma tra loro disgiunti e di cui non si conosce la corretta posizione occupata all’interno del genoma d’origine. Alla maggior parte dei programmi manca una fase di “scaffolding” e “finishing”, in cui tutti i frammenti prodotti con l’assemblaggio vengono ordinati e orientati, creando gli scaffolds. Il mio scopo era di realizzare un metodo di scaffolding, Consort, e di analisi per il miglioramento dell’assemblaggio ottenuto. Il programma richiede come dati di input un insieme di contigs prodotti assemblando le reads 454 con il Newbler, e un insieme di mate-pairs generati con il SOLiD. La predizione genica è stata la mia seconda area di ricerca. E’ un problema ben studiato e negli anni moltissimi programmi sono stati sviluppati per predire efficientemente i geni contenuti in un genoma. Tra questi i più utilizzati e conosciuti sono: Jigsaw, GeneID, GeneSplice, Genscan, Glimmer, SNAP, TigrScan, Twinscan. La maggior parte dei software richiede un insieme di dati di allenamento dal quale apprendere le caratteristiche per eseguire la successiva predizione, che molto spesso non sono disponibili. Pertanto, si devono creare a partire da genomi simili. Tuttavia, questa soluzione non è sempre applicabile, anche se molto spesso lavora bene e permette di ottenere buon risultati. Infatti, se l’organismo studiato è nuovo e non se ne conoscono altri di abbastanza vicini, si rischia di non avere i i dati richiesti. La mia ricerca in quest’area si applica allo sviluppo di un metodo di creazione di un insieme di dati di allenamento a partire da sequenze di trascriptoma dello stesso organismo. L’idea è di allineare le reads prodotte sul genoma e di estrarre tutte le regioni individuate, che sono potenziali geni. L’algoritmo implementato ha mostrato la possibilità di ricavare insieme di dati sicuri con questa tecnica. Tuttavia, il metodo è soggetto alla predizione di molti falsi positivi a causa dell’elevato rumore di fondo. Per evitare di creare un training set poco affidabile, è preferibile essere molto stringenti nei criteri di selezione dei geni.