Metodi di caratterizzazione di Scaffold per l'ingegneria Tissutale

Con il termine ingegneria tissutale vengono identificate le procedure indirizzate alla rigenerazione di tessuti del corpo che prevedono la semina di cellule su un supporto opportuno (scaffold) seguita dalla loro coltivazione in appositi bioreattori fino ad ottenere un nuovo tessuto da trapiantare nel paziente. Lo scaffold, realizzato in materiali biodegradabili o bioassorbibili ha quindi un ruolo transitorio ma molto importante: deve infatti fornire un supporto fisico per l’adesione e la crescita cellulare ma, alla fine del processo, deve essere completamente riassorbito lasciando il posto ad un tessuto neoformato. Idealmente le cellule necessarie alla semina e alla colonizzazione dello scaffold potrebbero essere fornite dal paziente in modo che il neotessuto formato, una volta impiantato, sia privo di reazione immunitaria di rigetto. In una prospettiva temporale più lunga, potrebbero essere utilizzate per la semina cellule di tipo staminale successivamente indotte a differenziarsi in vitro in un particolare fenotipo tissutale (osso, cartilagine, muscolo, etc.). In questo lavoro di Tesi, l’attenzione è stata focalizzata soprattutto su alcune tecniche di indagine strutturale applicate allo studio di scaffolds per ingegneria tissutale adatti alla adesione e alla crescita cellulare. Non è superfluo evidenziare, infatti, l’importanza fondamentale che il materiale e la struttura dello scaffold hanno al fine di arrivare al successo delle funzioni di supporto e di crescita cellulare. In particolare, sono state utilizzate due specifiche tecniche di analisi: la microscopia a scansione elettronica (SEM) e la microtomografia computerizzata (Micro-TAC). Le due tecniche di indagine strutturale e morfologica sono state applicate all’analisi di polimeri del tipo PLLA e PCL. Nell’introduzione sono state descritte le tecniche sopracitate, ponendo particolare enfasi alla tecnica SEM che ha permesso di analizzare le superfici polimeriche sia prima che dopo impianto di colture cellulari. Nella sezione dedicata ai materiali e metodi sono state descritte ampiamente le tecniche di preparazione degli scaffold in PLLA e in PCL. I costrutti in PLLA sono idealmente indirizzati per un utilizzo come sostituti vascolari, specialmente se elasticizzati con trietilcitrato. Invece gli scaffolds in PCL sono stati preparati utilizzando una tecnica innovativa detta gel-forming e sono indirizzati verso un utilizzo quali sostituti di osso. Le osservazioni al SEM dei numerosi scaffolds vascolari in PLLA evidenziano come la porosità media dei preparati aumenti in accordo con l’aumento della quantità di plastificante. L’adesione delle cellule HUVEC agli scaffolds realizzati in PLLA, sempre valutata mediante osservazione al SEM, sembra dipendere soprattutto dalla porosità, aumentando in un certo intervallo con essa. Il condizionamento post-assemblaggio degli scaffolds in PLLA con la fibronectina, una tipica proteina della matrice extracellulare deputata alla adesione cellulare, migliora generalmente l’adesione. L’assemblamento degli scaffolds in PCL mediante gel-forming ha permesso di produrre una matrice solida con microporosità uniforme di pori interconnessi, come dimostrato dall’osservazione al SEM, dal saggio di perfusione con fuscina e, infine, dall’analisi con Micro-TAC. La tecnica di gel-forming con PCL permette di riprodurre forma e dimensioni di qualsiasi osso, ma bisogna correggere la leggera contrazione dello scaffold finale predisponendo uno stampo sovradimensionato del 10% circa. La tecnica gel-forming permette di inglobare vari additivi durante la fase di assemblamento, in particolare sono stati preparati numerosi scaffolds in PCL/saccarosio, PCL/idrossiapatite e, infine, PCL/saccarosio/idrossiapatite che sono stati studiati con SEM e mediante Micro-TAC. Il saccarosio, di opportuna granulometria, realizza, dopo rimozione con acqua, dei macropori nella matrice microporosa del PCL che facilitano potenzialmente la colonizzazione da parte delle cellule dello scaffold. L’aggiunta di idrossiapatite aumenta la resistenza meccanica degli scaffolds in PCL ma, se eccessiva, può renderli più fragili; essa dovrebbe anche migliorare l’adesione e la crescita di cellule del tessuto osseo, in particolare degli osteoblasti. La crescita di cellule sulle varie tipologie di scaffolds in PCL, prodotte in questo lavoro, non è stata esaminata sperimentalmente.