Heat Shock Protein 70 nel linfoma anaplastico a grandi cellule: ruolo, espressione e correlazione con la tirosin chinasi NPM-ALK

I linfomi anaplastici a grandi cellule (ALCL) pediatrici sono caratterizzati, per più dell’90%, dalla presenza della caratteristica traslocazione cromosomica t(2;5) da cui origina il trascritto codificante per NPM-ALK, chinasi oncogena essenziale per la trasformazione della cellula linfoide normale e per la sopravvivenza della cellula neoplastica. Oltre al suo potenziale promitogenico e antiapoptotico mediato dall’attivazione dei pathway di PI3K/Akt e STAT3, studi recenti hanno dimostrato il ruolo di NPM-ALK nell’attivazione di MEK, ERK1/2 e p38- MAPK. Tuttavia, nonostante le numerose conoscenze sull’attività trasformante di NPM-ALK sia in vivo che in vitro, poco è noto sui meccanismi di chemioresistenza indotti dalla stessa chinasi, anche se forte rimane l’interesse per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate per la cura dell’ALCL. In un nostro studio precedente abbiamo dimostrato che in linee cellulari di ALCL NPM-ALK positive (NPM-ALK+) l’inibitore proteosomale Bortezomib (BZ) provoca l’induzione di Hsp70, una heat shock protein normalmente coinvolta nella maturazione e nella preservazione della conformazione della maggioranza delle proteine cellulari ma che induce anche fenomeni di chemioresistenza in molti modelli sperimentali tumorali. In questo studio abbiamo quindi valutato lo stato e la funzione di Hsp70 in linee cellulari e in preparati istologici di pazienti pediatrici affetti da ALCL, e i possibili meccanismi di resistenza al trattamento farmacologico (BZ) o allo stress cellulare (heat shock, HS) che favorirebbero la sopravvivenza delle cellule NPM-ALK+. Abbiamo dimostrato che Hsp70 risulta espressa ad alti livelli nelle linee cellulari NPM-ALK+ grazie alla capacità di queste cellule di attivare efficacemente il fattore di trascrizione delle hsp, HSF1. Dalle nostre analisi è emerso inoltre che Hsp70 interagisce con HSF1 nella sua forma fosforilata e attiva, ma solo nelle linee cellulari NPM-ALK+. Ciò lascia supporre che Hsp70 possa regolare positivamente la trascrizione delle hsp mediante un meccanismo a feed-back. Inoltre abbiamo dimostrato che, quando indotta dopo trattamento con BZ o shock termico, in linee cellulari NPM-ALK+ Hsp70 previene la perdita dell’omeostasi mitocondriale e il rilascio transmembrana di fattori apoptogenici, attraverso l’inibizione della proteina pro-apoptotica mitocondriale Bax. Questo giustificherebbe la resistenza al trattamento farmacologico evidenziata nelle linee cellulari NPM-ALK+ rispetto alla linea di ALCL che non esprime NPM-ALK. L’analisi dell’espressione di Hsp70 e’ stata quindi estesa a 23 preparati istologici di pazienti pediatrici affetti da ALCL, 20 NPM-ALK+ e 3 NPM-ALK-. Mediante analisi 2 immunoistochimica, abbiamo verificato che la totalità delle biopsie NPM-ALK+ è risultata positiva ad Hsp70, rispetto a solo uno su tre dei casi NPM-ALK-, confermando statisticamente (p=0.019) una correlazione tra la presenza di NPM-ALK e Hsp70. Data la limitata numerosità dei campioni non è stato possibile correlare in maniera statistica l’espressione di Hsp70 con l’andamento della malattia, ma è da sottolineare come il 67% dei casi (4/6) con elevata espressione di Hsp70 (valore attribuito pari a 3, in una scala di espressione crescente da 0 a 3) siano recidivati o deceduti, contro solo il 25% (3/12) dei casi con espressione della proteina assente o intermedia (compresa tra 0 e 2, nella stessa scala). Abbiamo verificato poi, che l’espressione del trascritto Hsp70 in biopsie linfonodali di bambini affetti da ALCL NPM-ALK+, è significativamente più elevata rispetto a quella riscontrata nei linfonodi reattivi non patologici (p=0.049). Per valutare il possibile ruolo di NPM-ALK nell’induzione di Hsp70, prima di esporre le cellule di ALCL in studio a trattamento con BZ o a calore (HS), la sua attività chinasica è stata inibita farmacologicamente (WHI-P154). I nostri studi dimostrano che nelle cellule trattate con WHI-P154, sia singolarmente che in combinazione con BZ o HS, HSF1 rimane localizzato nel citoplasma con conseguente calo del trascritto e dell’espressione di Hsp70. Infine abbiamo dimostrato che la combinazione di dosi singolarmente non citotossiche, o al più citostatiche di BZ e WHI-P154, inibisce la proliferazione cellulare e induce apoptosi nelle linee cellulari che esprimono NPM-ALK, effetto al quale concorre l’inibizione della trascrizione e dell’espressione di Hsp70, oltre ad altri numerosi fattori dipendenti dall’attività della chinasi.