Studio del ruolo dei miRNA nella patogenesi dell'epatocarcinoma hcv-correlato

INTRODUZIONE: I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti il cui ruolo di regolazione dell’espressione genica è stato scoperto e via via delucidato in anni recenti. L’azione dei miRNA, non dissimilmente da quella di altre tipologie di RNA non codificanti (comunemente chiamata RNA-interference), si esprime nell’interazione fisica specifica con trascritti genici (mRNA) e nell’impedimento o comunque nella riduzione quantitativa della produzione a partire da questi ultimi di proteine. L’effetto biologico del miRNA dipende pertanto dalla natura del suo bersaglio. Non è al momento disponibile una mappa precisa dei bersagli di ciascuno dei circa 700 miRNA umani, ma alcuni studi di genomica funzionale hanno già dimostrato per alcuni di essi un coinvolgimento diretto nei meccanismi patogenetici di numerose patologie fra cui il cancro. L’epatocarcinoma (HCC) è fra i tumori umani uno dei più aggressivi e tanto la sua diagnosi precoce quanto ancor più la sua terapia permangono alquanto problematiche. D’altro canto, i fattori che ne provocano e promuovono l’insorgenza (virus epatitici, abuso di alcool le più comuni) sono a loro volta costantemente presenti nella popolazione e potenzialmente in aumento. Molte ragioni quindi possono consigliare la ricerca di nuove linee strategiche che, partendo dall’analisi scientifica, possano sfociare nel medio periodo in miglioramenti nella gestione sanitaria della patologia. Nel caso dei micro-RNA, sono già stati effettuati numerosi studi miranti a mostrare l’esistenza di un preciso schema nell’espressione di specifici miRNA nei fegati affetti da HCC, tuttavia manca al momento un chiaro consenso sulla questione, nonché il quanto mai necessario raccordo con lo studio dei medesimi in ambiti clinicamente distinti ma biologicamente attinenti quali epatite cronica , fibrosi epatica, cirrosi. Concludendo, numerose evidenze scientifiche consigliano di sviluppare e mettere in atto analisi quantitative e qualitative sui miRNA nei tessuti di pazienti affetti da HCC, per poter raccogliere dati necessari ad una miglior comprensione della patogenesi del tumore ma anche per poter studiare meglio le sue cause. Nondimeno, tali studi possono essere sfruttati nel medio periodo per la generazione di modelli biologici utili ai fini dello sviluppo di nuovi approcci terapeutici. OBIETTIVI: Partendo da tali presupposti ed entrando nello specifico di questo studio, gli obiettivi sono: - Sul piano metodologico, la definizione di un protocollo generale per l’analisi dei miRNA in campioni tissutali, nella prospettiva di una rapida diffusione di questo genere di ricerche nell’ambito biomedico. - Sul piano scientifico, il monitoraggio dell’espressione di un pannello di miRNA specifici per il fegato potenzialmente utili per identificare le tappe della progressione dalla patologia epatica all’HCC. Questo tipo di analisi viene svolta in un contesto comparativo ( tessuto tumorale contro tessuto normale) e può fornire le basi per futuri studi focalizzati su interazioni molecolari e funzionali tra miRNA specifici e geni di interesse. DISEGNO DELLO STUDIO 1.Indagine sull'espressione di un pannello di miRNA fegato-specifici e associati a tumore in una serie di campioni di pazienti con tumore epatico HCV-associate (principalmente HCC HCV-collegato) tramite metodiche di RT-real time -PCR 2. Analisi della presenza di HCV con PCR nei campioni di tessuto, e analisi del genotipo e sottotipo di HCV mediante sequenziamento automatico; confronto del profilo di espressione di miRNA con i dati virologici. RISULTATI I risultati dei nostri studi su HCC, ottenuti mediante Real Time PCR con primers specifici per un ristretto pannello di miRNA, hanno permesso di individuare delle differenze nell’espressione di alcuni di questi geni tra campioni di tessuto tumorale e campioni di tessuto normale adiacente. In particolare abbiamo confermato una significativa sottoespressione di mir-199a, presente in quasi il 70% dei casi analizzati, mentre altri (fra cui: mir-195, mir-122a, mir-199b) presentano deregolazioni leggermente meno frequenti ma pur sempre significative (50-65%). Un solo miRNA del pannello selezionato, mir-222, presenta una deregolazione nel senso di una sovraespressione nel tessuto tumorale rispetto a quello sano, in una percentuale superiore al 40%. Gli altri micro-RNA presi in esame non danno, con questa metodica, differenze significative fra i due tipi di tessuto. Considerazioni leggermente differenti derivano dal confronto dei dati relativi a campioni HCV positivi e negativi. Questi dati sono compatibili con quelli riferiti nella letteratura pregressa, dimostrando l’attendibilità delle tecniche utilizzate. L’ attività avviata parallelamente ha riguardato la ricerca di genomi virali di HCV, e successivamente l’analisi delle sequenze virali. Unendo i risultati dell’analisi ai dati clinici disponibili, 20 pazienti su 29 risultano HCV-positivi. Circa le sequenze virali amplificate e analizzate, il confronto coi database bioinformatici ci dà per risultato che il 70% circa dei pazienti HCV-positivi appartiene al gruppo del sottotipo 1b, il 15% al gruppo 1a, e l’altro 15% al gruppo 2. CONCLUSIONI In conclusione, questo studio ha permesso sia di testare e mettere a punto protocolli di analisi trasferibili nel breve periodo ad altri studi scientifici, sia di raccogliere dati sull’espressione dei miRNA nell’epatocarcinoma che, pur necessitando di indagini ulteriori, appaiono interessanti indizi di una de-regolazione genetica specifica di questa condizione patologica.