SVILUPPO DI SISTEMI NANOPARTICELLARI D'ORO PER IL DIREZIONAMENTO MULTI-MODALE AL TUMORE

Il presente progetto di ricerca ha riguardato lo sviluppo di un nano-sistema intelligente, capace di rispondere selettivamente a stimoli esterni di tipo fisiopatologico con alterazioni morfologiche. Tali sistemi sono stati disegnati per un impiego in diagnostica o nella terapia antitumorale. La responsività di questi sistemi ha lo scopo di migliorare l’ efficienza del direzionamento selettivo e di ridurre la distribuzione aspecifica nei tessuti sani. Sistemi intelligenti sono stati ottenuti a partire da nanoparticelle d’ oro (AuNPs), a cui sono stati associati polimeri responsivi, che conferiscono loro caratteristiche stealth in condizioni fisiologiche in seguito ad iniezione nel torrente circolatorio. E’ noto che l’ interstizio tumorale è aratterizzato da valori di pH e temperatura alterati rispetto al tessuto sano. Di conseguenza, quando il nano-sistema raggiunge il tumore, il rivestimento polimerico può² subire modifiche morfologiche che modulano le proprietà delle nanoparticelle. Questo promuoverà la loro interazione con le superfici biologiche, quali cellule e tessuti. Nel progetto qui discusso, sono state valutate diverse strategie di funzionalizzazione di AuNPs, allo scopo di sviluppare nano-carriers caratterizzati da un direzionamento multi-modale al tumore. Nanoparticelle d’ oro sono state derivatizzate superficialmente con agenti di direzionamento e polimeri termosensibili o pH sensibili, affinchè il riconoscimento selettivo del tessuto tumorale da parte dei nano-carriers sia controllato dalle condizioni di temperatura o di pH circostanti. In condizioni fisiologiche i polimeri presenti sulla superficie delle AuNPs schermano l’ agente di targeting, mentre nel tessuto tumorale grazie alla temperatura o pH alterati, essi collassano determinando l’ esposizione del direzionante e promuovendo l’ endocitosi cellulare. Come conseguenza, il direzionamento multi-modale diminuirà il bio-riconoscimento aspecifico a favore invece della sito-specificità. Le nanoparticelle d’ oro utilizzate in questo progetto sono state prodotte mediante laser ablation in soluzione acquosa, senza utilizzo di sostanze surfattanti e stabilizzanti. Attraverso questo processo controllato e riproducibile si sono ottenute dispersioni di particelle diluite, con diametro medio di 18 nm. Per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro i materiali utilizzati sono stati tiolati, nota l’ elevata capacità di coniugazione di gruppi sulfidrilici su superfici d’ oro metallico. Il primo sistema sviluppato in questo progetto di tesi ha riguardo l’ impiego di nanoparticelle d’ oro in grado di rispondere a stimoli termici. AuNPs sono state modificate superficialmente con biotina-SH e con un polimero termosensibile di 8 kDa, N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-SH (pNIPAm-co-Am-SH), caratterizzato da una low critical solution temperature (LCST) di 37 °C. Il sistema ottenuto è stato testato mediante saggio enzimatico di tipo ELISA per valutarne la capacità di binding selettivo ad avidina, scelta come modello, in funzione della temperatura. I risultati hanno mostrato che il comportamento del sistema è controllato dalla temperatura, in quanto le nanoparticelle sono in grado di legare l’ avidina solo quando la temperatura è superiore all’ LCST del polimero, ovvero quando il polimero stesso collassa. Lo studio ha inoltre evidenziato che la quantità assoluta di biotina e i rapporti molari biotina/polimero sulla superficie delle nanoparticelle condizionano in modo rilevante le performance del sistema Sulla base delle ottimizzazioni realizzate con le nanoparticelle direzionate con biotina, il sistema è stato modificato superficialmente con acido folico e lo stesso polimero termosensibile (pNIPAm-co-Am-SH), allo scopo di ottenere un direzionamento verso cellule tumorali sovraesprimenti il recettore per il folato (HiFR). Gli studi di stabilità in PBS hanno mostrato come il polimero termosensibile sia indispensabile per impedire l’ aggregazione delle particelle in presenza di sali. A temperatura inferiore all’ LCST del polimero le nanoparticelle sono stabili, ed aggregano solo marginalmente a temperatura superiore. AuNPs termosensibili e funzionalizzate con acido folico sono state testate in vitro su due diverse linee celluari, sovraesprimenti e non il recettore per l’ acido folico. Gli studi hanno mostrato che solo le particelle termosensibili modificate con acido folico e incubate con linee cellulari HiFR, a temperatura superiore all’ LCST del polimero, vengono internalizzate dalle cellule e si distribuiscono nel citosol. Il concetto di targeting multi-modale è stato successivamente ampliato per lo sviluppo di nanoparticelle d’ oro pH-sensibili, utilizzando polimeri in grado di rispondere con cambiamenti morfologici ad alterazioni del pH ambientale. Idealmente, polimeri acido sensibili adeguati allo scopo devono essere solubili ed in conformazione estesa a pH 7.4, ma subire una conversione allo stato globulare insolubile in seguito a protonazione nell’ ambiente acido tumorale. Per raggiungere questo obiettivo sono stati sintetizzati diversi polimeri pH-sensibili, in modo tale da disporre di una gamma di materiali caratterizzati da valori di pKa e cloud point adeguati allo scopo, tra cui poter selezionare il più¹ adatto per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro. I materali sono stati disegnati per conferire alle AuNPs proprietà di acido-sensibilità nel range fisiopatologico. E’ stato selezionato e sintetizzato un monomero acido-sensibile, 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato (MOECHB), a partire dal quale sono stati poi prodotti polimeri pH responsivi. La metodica adottata per la reazione di polimerizzazione fa parte delle cosiddette tecniche di polimerizzazioni viventi, ovvero la reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). Sono stati sintetizzati un omopolimero e diversi copolimeri sia random che a blocchi utilizzando MOECHB e monomeri idrofilici, nello specifico metossi(polietilenglicole metacrilato) (mPEGMA475), e glicerolo metacrilato (GMA). Tutti i polimeri ottenuti sono stati caratterizzati mediante titolazione potenziometrica per determinarne il pKa, e sottoposti ad analisi turbidimetrica per misurare il punto di intorbidimento (cloud point). Il loro comportamento pH-dipendente è stato inoltre investigato mediante analisi di dynamic light scattering (DLS) effettuate a diversi valori di pH. Sono stati selezionati un copolimero random e due copolimeri a blocchi, composti da MOECHB e GMA, per ulteriori studi di funzionalizzazione di nanoparticelle d’ oro. Infatti questi materiali hanno mostrato una conversione da una forma solubile ad una aggregata insolubile per diminuzione del pH della soluzione da 7.4 a 6.5, che mima le condizioni fisiopatologiche. Un ulteriore copolimero a blocchi di MOECHB con mPEGMA475 sarà valutato, in quanto nelle medesime condizioni ha mostrato modifiche morfologiche, sebbene non si sia osservata la formazione di prodotti insolubili. I risultati delle analisi hanno evidenziato infine che la responsività al pH è modulata dal rapporto molare 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato/monomero idrofilico nella composizione polimerica, così come dal peso molecolare del polimero.