Human cell response to ionizing radiation in ground gravity and microgravity condition

Le radiazioni ionizzanti (IR), colpendo le cellule degli organismi eucarioti è in grado di provocare danni a proteine, lipidi e molecole di DNA, in modo diretto o indiretto come risultato della formazione di radicali liberi. Tra i numerosi tipi di danno al DNA, le rotture a doppio filamento o double-strand breaks (DSBs) rappresentano il tipo di lesione più grave, dal momento che una riparazione inefficiente o non accurata può portare a morte cellulare o instabilità genomica. La presenza di DSBs induce una complessa risposta al danno al DNA che vede coinvolti una serie di eventi cellulari quali: la rilevazione del danno, la trasduzione del segnale agli effettori della riparazione, l’arresto del ciclo cellulare e l’induzione di apoptosi. Nei mammiferi, una delle risposte cellulari più precoci dopo l’induzione di una doppia rottura è la fosforilazione dell’istone H2AX (γ-H2AX) in corrispondenza del sito di danno, che avviene per opera delle fosfatidilinositolol-3-OH-chinasi (ATM, DNA-PK and ATR). Questo evento sembra essere importante nel reclutamento di fattori di segnalazione del danno e di proteine coinvolte nella riparazione delle DSBs nei siti danneggiati (i.e 53BP1, Mre11, Rad50, Nbs1), dando origine a ionizing radiation-induced foci (IRIF), che possono essere costituiti da migliaia di queste molecole proteiche. Monitorando la cinetica di formazione e scomparsa degli IRIF, che si accumulano nei siti danneggiati, è possibile analizzare il danno al DNA e la sua riparazione; in particolare, è stato osservato che la diminuzione dei foci di γ-H2AX correla con la progressione della riparazione delle DSBs. Gli eventi di segnalazione attivati in risposta alle radiazioni ionizzanti dipendono, oltre che dalle caratteristiche genetiche e fisiologiche del sistema biologico osservato, anche dalle condizioni ambientali presenti durante la riparazione del DNA. Per questa ragione abbiamo analizzato e confrontato la risposta cellulare umana alle IR in condizioni diverse di gravità, normale come sulla Terra (1g) e ridotta come nell’ambiente spaziale; in quest’ultimo l’esposizione ai raggi cosmici a cui l’uomo è soggetto durante le missioni spaziali e associata alla riduzione della forza di gravità. L’ambiente spaziale è caratterizzato dalla presenza di radiazioni ionizzanti, nella forma di particelle atomiche cariche che rappresentano il più importante fattore limitante la lunga permanenza dell’uomo nello spazio, ma anche dalla condizione di assenza di peso, che prende il nome di microgravità (10-4–10-6g). In letteratura sono stati riportati alcuni effetti della microgravità osservati in astronauti di ritorno dai voli spaziali, questi riguardano: la soppressione del sistema immunitario, l’atrofia muscolare, problemi cardiovascolari e la demineralizzazione e decalcificazione ossea. Cellule mantenute in coltura durante le missione spaziali e modelli a terra della microgravità mostrano inibizione della proliferazione dei linfociti, soppressione o alterazione della secrezione di citochine, modificazioni del citoscheletro e anche incremento delle aberrazioni cromosomiche e apoptosi. Pertanto, capire se gli effetti della radiazione ionizzante possano essere influenzati dalla microgravità rimane un punto di rilevante importanza nella valutazione dei rischi durante le missioni spaziali. In questo lavoro, la microgravità è stata simulata in laboratorio usando il bioreattore “Rotating Wall Vessel” (Synthecon) messo a punto nei laboratori della NASA a Houston; questo strumento permette di riprodurre un aspetto dei voli spaziali che è l’assenza di peso, condizione che prende il nome di “modeled microgravity” (MMG). Nella prima parte di questo progetto è stata studiata la riparazione delle DSBs in linfociti umani irradiati con raggi gamma e mantenuti durante il tempo di riparazione in 1g o MMG. La formazione e la scomparsa dei foci dell’istone γ-H2AX è stata monitorata a diversi tempi dall’irradiazione mediante immunofluorescenza; nei medesimi campioni è stato anche analizzato l’indice apoptotico e la frammentazione del DNA, quest’ultimo con la tecnica della pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) in cui la frazione di DNA rilasciata nel gel (FR) è considerata una misura delle DSBs. I risultati ottenuti confermano che l’incubazione in MMG durante il tempo di riparazione influenza la sopravvivenza cellulare, l’apoptosi e ritarda la riparazione delle DSBs, incrementando l’effetto genotossico delle radiazioni ionizzanti. Sulla base delle osservazioni fatte, si è passati a studiare se la IR e la MMG possono avere un’azione sinergica sulle cellule analizzando i profili di espressione dei microRNAs: regolatori negativi dell’espressione genica. I microRNAs (miRNAs) sono una classe di corti RNA (~22nt) endogeni, che svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari poiché reprimono l’espressione dei mRNA target. Nelle cellule animali, queste molecole vanno a reprimere la traduzione dei geni codificanti proteine legandosi a sequenze complementari nelle regioni non tradotte al 3’ terminale (3’UTR) dei mRNA. Per questo motivo i miRNAs sono coinvolti in numerosi processi biologici come: lo sviluppo, la proliferazione cellulare, l’apoptosi, la funzionalità delle cellule staminali e la tumorigenesi. Scopo: Questo progetto si proponeva di: i) analizzare l’efficienza di riparazione del DNA in condizione di microgravità simulata (MMG), puntando l’attenzione alla cinetica di riparazione delle DSBs; ii) capire se la radiazione ionizzante e la microgravità simulata possono avere un’azione sinergica in cellule umane, confrontando i miRNA radio-responsivi nelle due condizioni di gravità (1g e MMG) Attività svolta: La presenza di foci nucleari dell’istone γ-H2AX e l’indice apoptotico sono stati monitorati in linfociti umani irradiati con raggi γ e non, incubati in 1g e MMG. Negli stessi campioni è stata studiata la riparazione delle DSBs analizzando la frazione di DNA rilasciata (FR) dopo Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). In seguito, usando l’approccio dei microarray con “Human miRNA microarray Kit V2” (Agilent) e della real-time qPCR, sono stati analizzati i profili di espressione dei miRNAs in linfociti umani irradiati con raggi γ e incubati in 1g e MMG. Impiegando poi i microarrays “Whole Human Genome Oligo Microarray” (Agilent) per gli stessi campioni di cellule, è stato possibile determinare i profili di espressione genica; allo scopo di identificare i probabili mRNA target dei miRNA radio-responsivi i dati di espressione dei miRNA e dei mRNA sono stati integrati in un’analisi di anticorrelazione. Infine, per studiare i processi biologici maggiormente coinvolti nella risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti è stata eseguita una Gene Ontology analysis (GO) applicata ai miRNA-mRNA target significativamente anti-correlati. Risultati e conclusioni: I risultati ottenuti dallo studio dei foci dell’istone γ-H2AX in PBL irradiati mostrano che il numero medio di foci/nucleo a tempi brevi di riparazione nelle due condizioni di gravità è comparabile. Al contrario, per tempi lunghi, la diminuzione del numero di foci è significativamente differente; infatti, a 24h dall’irradiazione i PBL incubati in 1g presentano 2 foci/nucleo, mentre quelli in MMG 6.4 foci/nucleo. Per verificare che la scomparsa dei foci di γ-H2AX fosse correlata con la riparazione delle DSBs è stata utilizzata la tecnica della PFGE. La cinetica di riparazione delle DSBs è stata analizzata in PBL irradiati e incubati in 1g e MMG; nelle cellule incubate in MMG il contenuto di DNA frammentato era maggiore rispetto alla 1g (FR 77% vs. 33% a 2 h e FR 50% vs. 17% a 6 h, rispettivamente). Probabilmente la MMG influisce sulle modificazioni strutturali della cromatina che avvengono in risposta alla DSBs, diminuendo l’efficienza di riparazione; pertanto, la riparazione delle DSBs che in 1g avviene in poche ore, richiede più tempo in MMG. Nella seconda parte del progetto sono stati analizzati i profili di espressione di miRNA in PBL irradiati con raggi γ e incubati in 1g e MMG. Dai risultati ottenuti è emerso che la radiazione altera i profili di espressione dei miRNA in modo dose e tempo dipendente, in entrambe le condizioni di gravità. L’esposizione ai raggi gamma in 1g altera i profili di espressione dei miRNA, sia a tempi brevi che lunghi, con maggior numero di miRNA radio-responsivi a 24h dopo esposizione alla dose maggiore (2Gy). Dal confronto dei profili di espressione di miRNA in PBL irradiati e mantenuti 24h nelle due condizioni di gravità vengono individuati miRNAs espressi in modo specifico durante l’incubazione in MMG; questi miRNAs vengono probabilmente alterati dall’azione combinata della IR con la MMG con effetto dose-dipendente. Anche le cellule non irradiate ma mantenute 24h in MMG presentano 42 miRNA deregolati rispetto alla 1g. Per far luce sul meccanismo col quale i miRNAs possono modulare alcuni processi biologici in risposta alle radiazioni ionizzanti, sono stati analizzati i profili di espressione di mRNAs negli stessi campioni per i quali sono stati ricavati i profili dei miRNAs. L’analisi di anti-correlazione tra i miRNA e i mRNA differenzialmente espressi e l’analisi computazionale con PITA hanno permesso di predire geni target dei miRNA. Infine, è stata eseguita la Gene Ontology analisi su geni target significativamente anti-correlati, allo scopo di identificare le categorie biologiche di appartenenza. Dai nostri risultati è emerso che alcuni geni sono attivati in PBL irradiati e incubati 24h sia in 1g che MMG, molti di loro sono gravità-specifici. In cellule irradiate con 2Gy e incubate in 1g un grande numero di mRNAs alterati appartiene alle categorie della risposta al danno al DNA (DDR): apoptosi, risposta allo stress, risposta al danno al DNA. Queste categorie non sono risultanti dall’analisi dei PBL irradiati e mantenuti in MMG, dove invece sono alterati processi coinvolti nel differenziamento e attivazione cellulare, sistema immunitario, produzione di citochine ed emopoiesi; tutte caratterizzate da una sostanziale down-regolazione genica. Questo studio fornisce prove che la MMG associata alla radiazione ionizzante porta ad una non appropriata risposta al danno al DNA in linfociti umani, dovuta probabilmente alla perdita di miRNAs radio-responsivi coinvolti nella DDR. Per meglio studiare le funzioni biologiche dei miRNAs in condizione di microgravità simulata è stato necessario puntare l’attenzione sulla validazione dei messageri target predetti e sull’analisi funzionale. Per questa ragione il programma finale di dottorato è stato svolto presso il laboratorio del Prof. Riccardo Dalla-Favera all’“Institute for Cancer Genetics” (Columbia University, New York, USA), per un periodo di sette mesi, allo scopo di acquisire competenze di biologia molecolare che vengono applicate allo studio dei microRNAs.