IL 17beta-ESTRADIOLO REGOLA L'ESPRESSIONE DEL TRASCRITTO DI fRLX IN Rana esculenta. ISOLAMENTO DA CERVELLO DI RANA DI UN NUOVO MEMBRO DELLA FAMIGLIA DELLE RELAXINE/INSULINE E DI UN RECETTORE fRXFP3

La Relaxina e l’Insulin-like factor (RLX e INSL) sono piccoli ormoni peptidici appartenenti alla superfamiglia dell’Insulina/IGF/Relaxine, ben caratterizzati nei Mammiferi e solo di recente ritrovati in modelli compresi in gruppi tassonomici di bassi Vertebrati. I peptidi appartenenti alla famiglia delle Relaxine sono codificati nell’uomo da sette geni differenti: i geni Relaxina RLX1, RLX2 e RLX3, i geni insulina simile INSL3, INSL4, INSL5, e INSL6 (Halls et al., 2007; Wilkinson et al., 2005b, Olinski, 2007). Analisi filogenetiche suggeriscono che essi possano derivare da un fenomeno di duplicazione che coinvolge tre locus genici denominati Relaxin Family Locus (RFL) evidenziati nei bassi vertebrati (Park et al., 2008). Benché le Relaxine siano presenti in diversi distretti anatomici, ricerche effettuate su Mammiferi ne associano le principali funzioni ai fenomeni riproduttivi. Per quanto concerne i Vertebrati nonmammiferi la ricerca sulle possibili funzioni è ad oggi un campo ancora completamente aperto. Vista la conservazione di locus genici della famiglia delle Relaxine nei bassi vertebrati, è stata verificata l’esistenza di ulteriori forme di RFL in Rana esculenta tramite un approccio bioinformatico analizzando il genoma dell’anfibio Xenopus tropicalis. Quest’analisi ha permesso di identificare quattro geni putativi conservati in Xenopus tropicalis corrispondenti alle tre famiglie RFL (RFLA, RFLB, RFLCI e CII). Sulla base dell’allineamento nucleotidico dei trascritti identificati, è stato dunque possibile disegnare coppie di oligonucleotidi “degenerati” da utilizzare in esperimenti di RT-PCR su RNA totale estratto da diversi tessuti di rana. In questo modo, utilizzando una coppia di primers disegnati sulla sequenza della RLX3 (RFLCI) si è ottenuto un amplificato di circa 360 cb, espresso esclusivamente nell’encefalo di rana. La banda ottenuta è stata, quindi, clonata e sequenziata: la sequenza ottenuta, una volta tradotta, presenta una cornice di lettura aperta di 120 aminoacidi. Tale sequenza, in seguito ad analisi in blastx, ha mostrato un’alta omologia con le proteine della famiglia delle Relaxine 3 depositate in banca dati genomica. In particolare, risultano essere altamente conservati il dominio strutturale della catena B e quello della catena A tipici di tutte le proteine appartenenti a questa famiglia. E’, inoltre, da tener presente che, nei mammiferi, la Relaxina-3 è espressa nel sistema nervoso a livello dei neuroni del nucleo incerto del ponte di Variolo, struttura presente nel tronco encefalico dove sembra svolgere la funzione di neuropeptide o neuromodulatore (Tregear et al., 2005; Sherie Ma. et al., 2009). Per verificare se il profilo di espressione della Relaxina-3 di rana fosse sovrapponibile a quello riscontrato nel SNC di mammifero, è stato effettuato un esperimento di RT-PCR su RNA totali estratti da differenti aree encefaliche di rana: cervello in toto, telencefalo, diencefalo e mesencefalo. Una prima analisi ha mostrato che il trascritto è altamente e specificamente espresso a livello della vescicola mesencefalica e diencefalica, mentre a livello del telencefalo il segnale risulta essere più basso, così come già evidenziato nei mammiferi. Parallelamente, al fine di poter intraprendere un discorso di tipo funzionale sul ruolo svolto da fRLX e fRLX3, si è cercato di identificare e caratterizzare i possibili recettori presenti in rana. Dalla letteratura risultano quattro recettori per le relaxine: RXFP1 (recettore specifico della Relaxina di mammifero), RXFP2 (recettore di INSL3), RXFP3 (RLN3) e RXFP4 (INSL5) (Bathgate et al., 2006) . Attraverso un’analisi di tipo bioinformatica basato sull’allineamento delle putative sequenze dei recettori presenti in banca dati, sono state disegnate delle coppie di primers degenerati che hanno permesso di amplificare dal cDNA di cervello di rana una banda specifica della lunghezza di 327 nucleotidi con sequenza molto conservata rispetto al recettore RXFP3 dei mammiferi. Dal momento che RXFP3 è il recettore specifico della Relaxina 3, si è deciso di effettuare anche un’analisi del profilo di espressione di fRXFP3 nelle diverse aree encefaliche di rana. L’analisi di RT-PCR ha mostrato che l’espressione di tale trascritto non corrisponde perfettamente a quella descritta per il ligando. Infatti, mentre i trascritti per fRLX3 sono maggiormente espressi a livello del Mesencefalo, non si osserva alcuna significativa differenza di espressione per l’mRNA di fRXFP3 a livello del Telencefalo e del Diencefalo. Questo dato coincide con quelli analizzati nei mammiferi. Infatti, come precedentemente affermato, evidenze anatomiche suggeriscono che la RLN3 sia prodotta nel soma dei neuroni GABA presenti nel ponte di Variolo e nel mesencefalo; essa è successivamente trasferita tramite trasporto assonale e rilasciata a livello dei siti sinaptici o extrasinaptici nella parte anteriore del cervello, dove attiva il suo recettore RXFP3 espresso dai neuroni postsinaptici (Tregear et al., 2005; Sherie Ma. et al., 2009).