The Double Face of Nucleic Acids

Dal giorno della loro scoperta più di un secolo fa, gli acidi nucleici sono stati analizzati e studiati approfonditamente in tutti gli aspetti, cercando di svelare gli ancora numerosi segreti nascosti nella loro struttura per comprenderne appieno le funzioni. Il ruolo più assodato ed essi associato è sicuramente quello di trasportatori dell’informazione genetica ma numerose evidenze sperimentali confermano il coinvolgimento in una serie di altri processi meno noti. Basta pensare a come l’RNA, grazie alle complesse conformazioni tridimensionali che può assumere dipendentemente dalla sua sequenza primaria, risulti coinvolto nel legame a svariate molecole e risulti ancor più straordinariamente responsabile di processi catalitici. Essendo quindi correlati a numerosi eventi cellulari, gli acidi nucleici sono utili bersagli terapeutici. Il presente lavoro è suddiviso essenzialmente in due parti ed è finalizzato alla comprensione di due aspetti differenti ma complementari legati agli acidi nucleici. Il primo progetto infatti si pone l’obiettivo di conoscere il vasto “mondo dell’RNA” e di applicare la straordinaria variabilità conformazionale di questo biopolimero ad un sistema terapeutico o diagnostico. La seconda parte della ricerca è invece indirizzata all’analisi dell’effetto di composti sul processo di integrazione del DNA, un meccanismo genetico che permette al DNA virale di essere correttamente inserito nel genoma dell’ospite. Gli acidi nucleici dimostrano quindi la loro “doppia faccia” intesa come la loro capacità di essere i protagonisti in sistemi di diagnosi o di terapia ma anche indispensabili attori co-protagonisti, essendo essi stessi i bersagli principali di numerosi farmaci. La prima metà del ciclo di dottorato di ricerca si è concentrata sull’uso della tecnologia SELEX. Inizialmente si è sviluppato un protocollo per la selezione di aptameri contro l’acido folico. Un totale di 12 cicli di SELEX mediante cromatografia d’affinità, hanno condotto alla selezione di un pool di molecole di RNA a singolo filamento, aventi un’elevata predisposizione a legare il target d’interesse. Il subclonaggio e il sequenziamento del suddetto insieme di molecole ha poi permesso di approfondire l’analisi delle caratteristiche tridimensionali degli oligonucleotidi e della minima sequenza responsabile del legame all’acido folico. A questo scopo, è stata condotta un’analisi informatizzata elementare ed è stato sviluppato un protocollo per l’RNase protection assay. L’associazione dei risultati ottenuti con le due diverse metodiche ha permesso di definire una chiara regione di interazione tra RNA e ligando. Questa minima sequenza è stata quindi sintetizzata chimicamente e sottoposta, mediante Isothermal Titration Calorimetry (ITC), alla determinazione della costante di legame, che è risultata essere nell’intervallo nanomolare. L’approvazione da parte di EMEA e FDA di Macugen®, un aptamero peghilato selettivo per il legame a VEGF e usato nel trattamento della degenerazione maculare senile, è una prova di come la SELEX possa essere un utile strumento per lo sviluppo di farmaci e diagnostici. Gli aptameri ad RNA contro l’acido folico selezionati nel presente lavoro possono ora seguire la via dello sviluppo per l’applicazione desiderata e ulteriori studi saranno condotti a questo scopo. La seconda metà del ciclo di dottorato di ricerca è stata invece svolta nel Laboratorio di Farmacologia Molecolare del National Cancer Institute (National Institute of Health - Bethesda - Maryland - USA) e ha preso in considerazione il processo di integrazione del DNA come bersaglio di farmaci anti-HIV. L’integrasi dell’HIV-1 è un enzima virale codificato dal gene POL e catalizza l’inserzione del DNA virale nei cromosomi della cellula ospite. Oligonucleotidi sintetici, con sequenza corrispondente alla porzione U5 terminale della LTR virale, sono stati utilizzati allo scopo di analizzare l’effetto di due importanti farmaci (raltegravir, il primo farmaco inibitore dell’integrasi approvato dall’FDA lo scorso anno, e elvitegravir, un composto in stadio avanzato di ricerca clinica) sull’enzima nativo ricombinante e su una serie di mutanti resistenti ai farmaci in questione. Lo studio è stato essenzialmente indirizzato a confrontare raltegravir e elvitegravir sullo stesso sistema in vitro, cercando di capire come differenti mutazioni aminoacidiche della proteina siano responsabili dell’insorgenza di resistenza al trattamento.