Isolamento, espansione e caratterizzazione fenotipica delle cellule staminali masenchimali da emocomponenti, sangue cordonale e sangue periferico mobilizzato

In Letteratura è stata descritta la presenza nella componente stromale del midollo osseo di un ristretto numero di cellule staminali mesenchimali (MSCs) con potenzialità multi-linea, differenziabili in tessuto osseo, cartilagineo, adiposo, tendineo, muscolare e nervoso. La plasticità di tali cellule potrebbe essere sfruttata a breve termine nell’ambito della medicina rigenerativa per lo sviluppo di protocolli clinici applicativi di terapia cellulare. Attualmente, altri tessuti del corpo umano sono indagati come ulteriore fonti alternative di MSCs. Il programma di ricerca si propone i seguenti obiettivi: sviluppo ed ottimizzazione di protocolli di isolamento specifici per le differenti fonti di approvvigionamento delle MSCs, quali sangue cordonale (CB), tessuto cordonale, midollo osseo (BM) di pazienti affetti da empatie maligne, sangue periferico (PB) mobilizzato, sangue periferico da donatori sani, come i Buffy Coat (BC), o da pazienti affetti da piaghe cutanee (CLP, concentrato leuco piastrinico); tentativo di espansione delle MSCs isolate; caratterizzazione fenotipica delle MSCs isolate rispetto a quella delle 5 linee stromali HM1 SV40, HM2 SV40, HCB1 SV40, BAEP2 WILD, BAEP2 SV40. L’isolamento di cellule mononucleate da campioni di CB, BM, PB mobilizzato, BC e CLP è stato condotto mediante 2 metodiche: tecnica di separazione su gradiente Ficoll-Histoprep di densità 1.077 g/ml secondo la tecnica di Boyum e deplezione dei globuli rossi con ammonio cloruro. Il tessuto cordonale invece è stato tagliato in minuscoli frammenti e messo direttamente in coltura. Sono stati valutati vari parametri di coltura primaria, quali il tempo trascorso dalla raccolta del campione al suo processamento, il terreno di coltura, la concentrazione di semina e le caratteristiche adesive dei contenitori di coltura dopo vari trattamenti. Le colture primarie così allestite sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 fino al raggiungimento della semi-confluenza; quindi le cellule sono state staccate del recipiente di coltura utilizzando una soluzione di Tripsina 0.25% ed EDTA 0.02% in PBS, e riseminate per l’espansione. Inoltre su 10 campioni di BC separati su Ficoll-Histoprep (5 di donatori di età compresa tra 18 e 36 anni e 5 di età compresa tra 50 e 65 anni) sono state allestite 10 diluizioni limite su piastre da 96 pozzetti, per verificare la crescita delle MSCs. Le letture al microscopio ad inversione sono state eseguite dopo 96 ore, 7 giorni e 14 giorni dall’allestimento della coltura. Infine è stata eseguita la caratterizzazione fenotipica delle cellule isolate da BC, seminate su piastre da 96 pozzetti, dopo 24 ore, 48 ore, 7 giorni e 14 giorni di coltura, mediante immunocitochimica, utilizzando un pannello di anticorpi per il riconoscimento di specifici antigeni di superficie per MSCs. Nelle colture di CB, PB mobilizzato e CLP il numero di cellule adese dopo 14 giorni dalla semina è modesto; le cellule appaiono polimorfe, sferoidali e più raramente fibroblastoidi. Al contrario, nelle colture di BC, in particolari condizioni, le cellule aderiscono al recipiente quasi immediatamente ed assumono subito una morfologia fusata. Nelle colture di BM di pazienti affetti da emopatie maligne, le cellule presentano al 7° giorno di coltura forma sferica, polimorfa e prevalentemente fibroblastoide e vanno a confluenza al 14° giorno. Per quanto riguarda i cordoni processati, dopo circa un mese di coltura le cellule sono a confluenza e formano un monostrato di cellule fibroblastoidi. L’espansione in vitro delle cellule isolate dai vari campioni è risultata difficoltosa, in quanto aderiscono fortemente al substrato e solo con 2 campioni di BC su 32 totali si è riusciti a raggiungere il 4° passaggio seriale. Le diluizioni limite non hanno evidenziato una crescita delle cellule dalle 96 ore alle 2 settimane di coltura e non si notano differenze significative tra i campioni di BC delle 2 diverse fasce di età. Le indagini immunocitochimiche condotte sulle colture primarie di BC hanno evidenziato le seguenti specificità anticorpali: EGF, EGF-R, FGF, FGF-R, ADM, RAMP2, ET-1, CD33, CD73, CD105, KDR e collagene I. Invece le MSCs non esprimono i seguenti marcatori di superficie: CD14, CD15, CD34, CD42b, CD71, HLA-DR, STRO-1, actina, desmina, fibronectina e laminina. Tali risultati sono comparabili a quelli ottenuti con le linee stromali HM1 SV40, HM2 SV40, HCB1 SV40, BAEP2 WILD, BAEP2 SV40, che sono da considerare il controllo positivo. In particolare le positività per i marcatori stromali mesenchimali CD73, CD105, oltre che per KDR, dimostrano che le cellule isolate da BC sono effettivamente MSCs. Questa sperimentazione preliminare fornisce alcune indicazioni per l’ottimizzazione dei metodi di coltura di MSCs isolate da fonti alternative al midollo osseo. Come descritto in Letteratura, i risultati della caratterizzazione fenotipica dimostrano che i marcatori cellulari delle cellule isolate da BC sono comparabili a quelli delle MSCs isolate da midollo osseo. Perciò i BC potrebbero essere un’importante fonte di cellule staminali adulte immediatamente sfruttabili in medicina rigenerativa, anche se sono ancora da chiarire l’origine di tali cellule, il loro significato fisio-patologico e il loro potenziale plastico.