Stem cell extracellular vesicles for neural regeneration

Negli ultimi anni, le cellule stromali mesenchimali multipotenti umane (CSM) hanno mostrato una grande efficacia terapeutica, soprattutto in approcci di terapia cellulare aventi come obiettivo la rigenerazione tissutale. L’azione delle CSM avviene attraverso supporto trofico, induzione di angiogenesi, modulazione della risposta immunitaria e diminuzione della necrosi a livello dei tessuti colpiti. Inoltre, recente letteratura ha dimostrato che queste capacità rigenerative e protettive sono in larga parte associate al secretoma delle CSM. Purtroppo, gli approcci di terapia cellulare non sono sempre traslabili alla clinica. Ad esempio, l’utilizzo di cellule staminali in patologie caratterizzate da una finestra terapeutica molto stretta, dell’ordine di poche ore, non è compatibile con la necessità di scongelare e valutare i minimi standard di qualità delle CSM prima della somministrazione al paziente. Nonostante ciò, il paradigma del meccanismo d’azione delle CSM nel campo della medicina rigenerativa si è ulteriormente arricchito. Infatti, molti recenti studi hanno dimostrato che le vescicole extracellulari, ossia porzioni di citoplasma delimitate da membrana cellulare secrete dalle CSM, sono in grado di riprodurre la maggior parte delle proprietà rigenerative delle CSM stesse. Date queste premesse, gli obiettivi del progetto di ricerca del presente Dottorato sono stati i seguenti: indagare la comunicazione intercellulare tramite vescicole extracellulari quale innovativo meccanismo d’azione delle CSM; studiare la produzione di vescicole extracellulari da parte di CSM riprogrammate, e, per la prima volta in letteratura, definirne il contenuto molecolare (es.: miRNoma), a confronto con le CSM d’origine; testare il potenziale terapeutico di vescicole extracellulari da cellule staminali in un modello di danno tissutale acuto, come proof-of-concept della funzionalità di una strategia terapeutica cell-free. Infatti, le vescicole extracellulari potrebbero essere prodotte in formulazioni pronte all’uso, a immediata disposizione per ogni richiesta clinica, anche urgente. In questo modo le proprietà rigenerative delle CSM potrebbero essere veicolate dalle vescicole extracellulari anche in contesti patologici attualmente senza alcuna opzione di terapia cellulare. Per lo sviluppo di questa innovativa strategia terapeutica, CSM isolate da vari tessuti sono state caratterizzate e confrontate in base al loro trascrittoma e al loro immunofenotipo, allo scopo di valutarne le proprietà biologiche e quindi scegliere le CSM più adatte all’implementazione del progetto di Dottorato. Le CSM da tessuti adulti (e.g.: midollo osseo) hanno mostrato in vitro caratteristiche di senescenza correlate all’età del donatore in vivo. Al contrario, le CSM da tessuti perinatali (e.g.: sangue di cordone ombelicale) hanno mostrato un fenotipo più simile a quello dei periciti, ossia i progenitori delle CSM in vivo. Quindi, tenuto conto anche della traslabilità clinica, il sangue di cordone ombelicale è stato scelto come fonte di CSM, visto che la raccolta e la crioconservazione di unità di sangue placentare a fini terapeutici è già una realtà clinica. In seguito, un’analisi estesa delle popolazioni stromali presenti nel sangue di cordone ombelicale ha portato alla definizione di una sottopopolazione di CSM dotata di maggiori capacità proliferative e con una lunghezza del telomero significativamente più alta. Inoltre il protocollo standard di isolamento delle CSM da sangue di cordone ombelicale è stato migliorato, arrivando ad un’efficienza di circa 80%. Infine, le proprietà anti-infiammatorie e anti-apoptotiche del secretoma delle CSM sono state studiate sia in vitro che in vivo. Al fine di verificare se le vescicole extracellulari contribuissero alle proprietà paracrine delle CSM, se ne è caratterizzata la secrezione e se ne sono indagate le proprietà rigenerative. Una chiara efficacia terapeutica da parte delle vescicole extracellulari di CSM è stata dimostrata in un modello in vitro di danno tissutale acuto, in cui le vescicole extracellulari hanno eguagliato i risultati ottenuti con le CSM stesse. Nonostante l’utilizzo di CSM dalle elevate proprietà proliferative, la loro lifespan in coltura, in quanto cellule primarie, rimane limitata. Allo scopo di aumentarne il potenziale replicativo e di sfruttarne al meglio così la produzione di vescicole extracellulari, le CSM sono state sottoposte alla riprogrammazione cellulare indotta. In questo modo sono state generate linee cellulari derivate da CSM dal potenziale di crescita illimitato, evitando però di modificarne il genoma come nelle tradizionali tecniche di immortalizzazione. Siccome la riprogrammazione implica una modificazione radicale dell’identità della cellula d’origine, il passo successivo è stato quello di confermare la capacità di questa nuova popolazione di generare vescicole extracellulari, poi opportunamente caratterizzate. In particolare, il miRNoma delle vescicole extracellulari da cellule riprogrammate è stato oggetto di studio e di confronto con quello delle vescicole extracellulari delle CSM d’origine. Si è così potuto dimostrare che la maggior parte dei miRNA era presente nelle vescicole extracellulari sia prima che dopo la riprogrammazione. Ciò indica che il processo di riprogrammazione non ne ha alterato in modo sostanziale il contenuto. Questo potrebbe avere importanti ricadute sugli aspetti funzionali delle vescicole extracellulari da CSM riprogrammate. Infatti è stato ipotizzato che il trasferimento di miRNA specifici da cellule donatrici a cellule target mediato dalle vescicole extracellulari sia uno dei meccanismi d’azione delle CSM. Nell’ultima parte di questo progetto di Dottorato, l’utilità terapeutica delle vescicole extracellulari da cellule staminali (CSM e CSM riprogrammate) è stata confrontata con quella delle CSM d’origine. A tale scopo è stato utilizzato un modello ex vivo di ischemia cerebrale, in cui è stato osservato il movimento di alcuni parametri di danno ischemico acuto, tra cui un picco di produzione di citochine infiammatorie, una forte necrosi tissutale e una riduzione delle popolazioni cellulari neuronali e astrocitiche. Questo particolare modello mima infatti la fase acuta di questa condizione patologica, il cui trattamento a base di agenti trombolitici deve avvenire entro 3-6 ore dall’insorgenza dei primi sintomi. Quindi le vescicole extracellulari prodotte dalle CSM riprogrammate sono state testate per la prima volta in questo contesto patologico per verificare se potessero esercitare una funzione rigenerativa. La loro somministrazione al tessuto colpito dal danno ischemico ha generato uno spiccato effetto neuroprotettivo, pari a quello delle CSM d’origine, che ha riportato a valori simili a quelli del tessuto cerebrale non danneggiato i parametri di danno sopra descritti. Il risultato più interessante e statisticamente significativo è stato soprattutto a carico di quei parametri legati ai processi infiammatori, i quali sfavoriscono il recupero del danno tissutale. In conclusione, i risultati presentati in questa tesi di Dottorato confermano la possibilità di utilizzo di vescicole extracellulari secrete da cellule staminali in strategie di medicina rigenerativa. Questa innovativa extracellular vesicle therapy potrebbe in futuro essere applicata in contesti patologici per i quali ad oggi non è praticabile una terapia cellulare. A questo punto, nel quadro dei prodotti medicinali per le terapie avanzate, il “farmaco” non sarebbe più la cellula staminale, ma le rispettive vescicole extracellulari. Queste acquisirebbero così il ruolo di carrier di molecole antinfiammatorie, pronte all’uso e capaci di garantire un’azione terapeutica tempestiva per la rigenerazione di tessuti danneggiati.