Applicazioni innovative della risonanza magnetica nucleare alle matrici alimentari. Uno studio sul caffè verde.

La qualità del caffè verde rappresenta il principale requisito per la realizzazione di una bevanda apprezzata a livello commerciale. Attualmente tra i vari campi interessati dalla produzione scientifica sulla qualità del caffè verde vi sono lo sviluppo di metodologie per garantire l’autenticità e lo studio delle metodiche più appropriate per la quantificazione dell’acqua. Nel primo caso la necessità di metodi rapidi per l’autenticazione del caffè è divenuta in tempi recenti un’esigenza sempre più pressante a causa della crescente diffusione di pratiche di adulterazione nella filiera commerciale di questo prodotto. Tuttavia sono ancora limitati i metodi formulati per la determinazione dell’origine geografica; inoltre, la bassa numerosità di campioni analizzati nei lavori compiuti in tale ambito rende i risultati trovati non sufficientemente significativi. Rimane infine ambiguità sui possibili markers da utilizzare nella discriminazione. Occorrono da un lato quindi metodi adatti ad analisi routinarie per il controllo del maggior numero possibile di campioni, e dall’altro una scelta univoca di possibili markers per la discriminazione geografica delle varie qualità di caffè. Nell’ambito degli studi compiuti sull’acqua rimane ancora aperta la problematica della distribuzione dell’acqua stessa all’interno della matrice. La comprensione di questo fenomeno è di notevole importanza in quanto è stata osservata ad esempio in letteratura la correlazione fra il grado di idratazione e le proprietà meccaniche del chicco verde. La ricerca presentata in questo dottorato ha cercato di dare una risposta alle problematiche aperte appena descritte con il ricorso alla Risonanza Magnetica Nucleare, recentemente utilizzata con successo in ambito alimentare. In questo lavoro sono stati sviluppati infatti due metodi per la determinazione dell’origine geografica del caffè verde, rispettivamente con l’NMR nel dominio dei tempi, e con l’NMr ad alta risoluzione, quest’ultimo in combinazione con l’analisi statistica multivariata. Il primo metodo, basato sull’NMR nel dominio dei tempi, è stato realizzato per mezzo di uno spettrometro operante alla frequenza di 20 MHz (Bruker Minispec Mq20), e permette la determinazione simultanea delle percentuali di acqua e olio di un elevato numero di campioni in maniera rapida e riproducibile tramite l’utilizzo della sequenza spin echo. I valori delle percentuali di acqua e olio nei campioni sottoposti ad analisi è stato ricavato utilizzando due differenti calibrazioni per l’acqua e per l’olio. Le percentuali di acqua e olio ottenute dall’applicazione del metodo su 500 campioni di caffè verde sono stati sottoposti ad analisi statistica (ANOVA). I risultati ottenuti indicano che una buona discriminazione dei continenti di provenienza dei campioni è possibile utilizzando il valore di percentuale di olio come marker. Per quantificare correttamente le componenti acqua e olio con la sequenza spin echo è stata necessaria l’analisi preliminare dei tempi di rilassamento trasversale (T2) nel chicco verde con l’NMR nel dominio dei tempi mediante l’applicazione della sequenza CPMG. Le distribuzioni continue di tempi di rilassamento trasversale sono state ricavate invertendo con la trasformata di Laplace con l’aiuto del software Upen le curve CPMG ottenute. L’assegnazione preliminare della popolazioni di T2 relative alla fase acqua nella regione compresa fra 0.1 e 3 ms è stata realizzata confrontando i profili di rilassamento di una serie di chicchi verdi con i corrispondenti profili ottenuti per essicazione in stufa. La regione di T2 relativa alla componente lipidica dei chicchi verdi è stata invece assegnata sia confrontando i profili di rilassamento di una serie di chicchi a diversi livelli di idratazione sia confrontando le distribuzioni di T2 nel chicco con quella dell’olio estratto dallo stesso. Allo scopo di far luce sulla distribuzione dell’acqua nel caffè verde la regione della distribuzione di T2 attribuita all’acqua è stata studiata in dettaglio con una serie di esperimenti sistematici di reidratazione graduale di chicchi precedentemente essiccati. Le distribuzioni di T2 ottenute da chicchi essiccati e reidratati manualmente fino al 35% (su base secca) sia con H2O che con D2O e, alternativamente, per esposizione in atmosfera di umidità controllata, sono state confrontate con quelle di chicchi verdi tal quali. I dati ottenuti indicano che fino a circa 10% l’acqua incorporata nel chicco manifesta una mobilità ridotta, in quanto probabilmente adsorbita o legata con le pareti cellulari mediante ponti idrogeno. La reidratazione con acqua deuterata ha evidenziato inoltre il contributo dello scambio protonico al segnale della distribuzione osservato. L’analisi dei profili di distribuzioni dell’acqua ha inoltre portato all’osservazione che questo risulta determinato dalla convoluzione di due popolazioni di mobilità protonica, rispettivamente centrate a circa 0.5 e 1 ms. Sia nel chicco verde che in quelli reidratati è stato trovato che a contenuti di acqua fino a 4% delle due popolazioni è visibile solo quella a mobilità inferiore, mentre a percentuali intermedie sono presenti entrambe. Con riferimento all’articolo di Pittia e collaboratori, la componente a rilassamento rapido potrebbe essere associata all’effetto di antiplasticizzazione dell’acqua, mentre la popolazione caratterizzata da rilassamento più lento può essere correlata all’effetto plasticizzante dell’acqua. In questo senso i nostri dati forniscono una conferma ed un’interpretazione in termini di mobilità protoniche al co-siddetto effetto di antiplasticizzazione, scoperto a livello macroscopico. La distribuzione dei tempi di rilassamento trasversale dei T2 della regione associata ai lipidi (cioè quella compresa fra circa10 ms e circa 300 ms) mostra un profilo multimodale, che suggerisce la presenza di tre diverse mobilità protoniche. Tale osservazione è stata confermata sia con lo studio della dipendenza dalla temperatura delle mobilità protoniche, compiuto sia per la fase lipidica all’interno dei chicchi, sia per l’olio fresco isolato mediante estrazione soxhlet, sia dal confronto con dati di letteratura. Questa osservazione ha trovato inoltre conferma nei dati di letteratura. Un metodo per la discriminazione geografica è stato infine elaborato mediante l’analisi statistica multivariata delle risonanze NMR sia degli estratti organici che acquosi di 48 campioni di caffè verde di diversa provenienza. I dati ottenuti indicano che nell’estratto organico gli acidi grassi sembrano essere efficaci nel discriminare i campioni africani da tutti gli altri analizzati, mentre le componenti minoritarie sono efficaci nella differenziazione tra i campioni con diversa provenienza. In particolare il Kahweolo correla positivamente con i campioni del Brasile, mentre la caffeina e i composti minoritari differenziano i campioni centro americani da quelli del sud America, e altri componenti minoritari non identificati che caratterizzano i campioni africani e quelli asiatici. La caratterizzazione dell’estratto acquoso mediante esperimenti bidimensionali ha permesso inoltre l’identificazione di sistemi di spin caratteristici degli estratti protonici del campioni di caffè brasiliano, quali zuccheri minoritari e isomeri dell’acido clorogenico. Esperimenti di diffusione DOSY condotti sull’estratto acquoso dei campioni di origine africana hanno inoltre avvalorato l’ipotesi di una possibile interazione caffeina/ acidi clorogenici. In particolare i dati ottenuti fanno supporre che nell’estratto acquoso del campione africano analizzato, la caffeina è presente in soluzione sia in forma libera che complessata con l’acido clorogenico.