Studi di riprogrammazione su cellule estratte da tessuto adiposo

Introduzione. L’ottenimento di cellule dotate di caratteristiche differenziative di tipo pluripotente a partire da cellule somatiche adulte è reso possibile mediante manipolazione dello status epigenetico. Il processo di metilazione del DNA è responsabile dell’espressione di proteine tessuto-specifiche e del silenziamento genico di fattori di trascrizione tipici della cellula germinale o tumorale. Al contrario, è stato dimostrato che il trattamento con agenti demetilanti è in grado di indurre in cellule animali multipotenti e in cellule stabilizzate l’espressione di proteine e fattori di trascrizione presenti nella cellula germinale (hTERT, OCT4). In questo studio è stato valutato l’effetto di un trattamento demetilante in vitro su cellule umane isolate da tessuto adiposo adulto (PLA cells). Materiali e metodi. Lo studio ha richiesto l’estrazione di cellule da tessuto adiposo omentale ottenuto mediante addominoplastica o liposuzione e l’analisi delle caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle PLA cells mediante tecniche di microscopia ottica e a fluorescenza, citofluorimetria e Western blotting a seguito del trattamento con l’agente demetilante 5-Azacitidina. Sono stati condotti studi preliminari sulla citotossicità del trattamento demetilante con saggi sull’attività delle deidrogenasi mitocondriali e sulla capacità proliferativa. Risultati. Negli studi di citotossicità dell’agente demetilante 5-Azacitidina, si è registrato una riduzione dell’attività metabolica mitocondriale nella popolazione trattata rispetto al controllo. Lo studio ha anche fornito le conoscenze per definire la concentrazione di agente demetilante rispetto al range riportato in letteratura. Le popolazioni trattate con l’agente demetilante hanno mostrato sofferenza durante l’espansione generazionale; la popolazione cellulare riseminata dopo distacco enzimatico presenta un numero di cellule significativamente inferiore rispetto al campione di controllo. D’altro lato, la popolazione presenta capacità proliferativa paragonabile a quella dei campioni non trattati, durante e dopo il trattamento demetilante. I due risultati potrebbero indicare che il trattamento demetilante non influisca sulla proprietà replicativa della cellula, ma ne riduca la capacità di adesione nella coltura in monostrato dopo il cambio generazionale. Poiché le PLA cells sono in grado di differenziare in altre tipologie cellulari, sono stati condotti studi di differenziamento in senso adipogenico, osteogenico e miogenico su popolazioni tratte in precedenza con l’agente demetilante. Il confronto con la risposta agli stimoli differenziativi di cellule non trattate ha dimostrato che l’agente demetilante non ha modificato la capacità differenziativa. Le indagini di microscopia a fluorescenza e Western blotting hanno mostrato che il fattore di trascrizione tessuto-specifico SREBP, presente nelle popolazioni di origine, è ugualmente espresso dopo il trattamento con 5-Azacitidina. La ricerca dei fattori di trascrizione NANOG e OCT4, responsabili della capacità di self-renewing nelle cellule pluripotenti non ha dato risultati positivi. Le cellule trattate con 5-Azacitidina sono state mantenute in coltura ed espanse, per valutare un eventuale rimodellamento proteomico nelle cellule replicate, ma non è stata registrata espressione dei due marcatori nucleari. Gli studi di caratterizzazione condotti con immunofluorescenza confocale e analisi citometriche hanno dimostrato che la popolazione cellulare isolata da tessuto adiposo è eterogenea. E’ stato osservato che, l’espansione generazionale determina un arricchimento nella componente cellulare CD90+/CD105+/CD29+, e cioè una popolazione con forti analogie fenotipiche con le cellule staminali stromali del midollo osseo, a scapito delle cellule endoteliali ed ematopoietiche presenti in origine. Inoltre, le cellule mantenute in coltura perdono il segnale dell’ADRP, proteina associata al commitment adipogenico, ed esibiscono una deplezione delle vescicole adipose citoplasmatiche, mentre è stato osservato nelle cellule di terza e quarta generazione la comparsa del marcatore di staminalità mesenchimale STRO1, espresso unicamente nella frazione stromale delle cellule staminali estratte da midollo osseo. Conclusioni. PLA cells di origine umana non si comportano in vitro dopo trattamento demetilante come le corrispondenti cellule di origine animale e cioè non sembrano essere in grado, nelle condizioni sperimentali usate in questo studio, di essere riprogrammate ad un fenotipo diverso da quello di origine. Questo risultato pone il problema dello stato di metilazione del DNA nelle cellule isolate da tessuto adiposo che mantenute a lungo in vitro assumono il fenotipo CD105+/ CD90+/STRO1+/ADRP-, e se un trattamento che preveda l’associazione di diversi agenti demetilanti/deacetilanti in combinazione con fattori di crescita possa realizzare in queste cellule una reale riprogrammazione funzionale in vitro.