Studio del ruolo dei microRNA nella maturazione e nella leucemogenesi T

La maturazione delle cellule T avviene attraverso una serie di complesse modificazioni fenotipiche e genotipiche ed è guidata da fattori e meccanismi in parte ancora poco compresi. Recenti lavori hanno mostrato che l'espressione di alcuni microRNA (miR) è dinamicamente regolata nel corso dello sviluppo ematopoietico, della risposta immunitaria e della leucemogenesi. Tuttavia, attualmente, è ancora in gran parte sconosciuto il ruolo dei miR nello sviluppo fisiologico delle cellule T, nonché il significato della loro alterata espressione nella leucemogenesi T. Allo scopo di identificare miR potenzialmente coinvolti nella differenziazione dei linfociti T, abbiamo analizzato il profilo d’espressione dei miR in timociti umani a diversi stadi di maturazione: Doppi Positivi (DP; CD4+CD8+), Singoli Positivi CD4+ (SP CD4; CD4+CD8-) e Singoli Positivi CD8+ (SP CD8, CD4-CD8+). Parallelamente, al fine di approfondire la nostra conoscenza sull’espressione dei miR nelle popolazioni linfoidi T, abbiamo generato delle librerie di small-RNA a partire dall’RNA totale di timociti non frazionati, timociti DP, linfociti maturi CD4+ e CD8+ del sangue periferico. L’analisi dei dati degli array ha mostrato che ogni popolazione timica presenta un profilo d’espressione dei miR caratteristico e distinto, che riflette le relazioni fra gli stadi di sviluppo dei precursori T. Nel corso della maturazione dei precursori T dallo stadio DP a quello SP si osserva una generale up-regolazione dell’espressione dei miR. La generazione delle librerie di small-RNA ci ha permesso di studiare l’espressione sia dei miR noti, che di nuovi candidati miR nelle diverse popolazioni linfoidi T. Al fine di identificare i miR noti e nuovi potenziali fra le sequenze delle librerie di small-RNA, è stata sviluppata una pipeline bioinformatica. L’analisi computazionale delle 29.744 sequenze di small-RNA ricavate dalle nostre librerie ha portato all’identificazione di 139 sequenze corrispondenti a miR noti e 98 sequenze di candidati nuovi miR. Mediante un'analisi bootstrap, è stato calcolato che, per tutte e 4 le librerie, il set di miR maturi sequenziati rappresenta più dell'80% della totalità dei miR che si stima siano espressi nei campioni. L’analisi delle librerie ha confermato la generale up-regolazione dell’espressione dei miR nel corso della maturazione delle cellule T. Comparando i dati degli array e del sequenziamento delle librerie, è stato individuato un gruppo di miR noti che sono consistentemente regolati durante la differenziazione T. Il pattern di espressione nei diversi stadi di sviluppo T di alcuni di questi miR, tra cui miR-150, è stato validato mediante qRT-PCR. In seguito, abbiamo fatto una ricerca dei target potenziali di questi miR integrando i risultati di 3 diversi software di predizione di target (Miranda, TargetScan and PicTar). Fra i candidati target del gruppo di miR d’interesse sono stati identificati molti geni coinvolti in processi biologici rilevanti, come la regolazione del ciclo cellulare, l’apoptosi, il differenziamento e la tumorigenesi. Inoltre, abbiamo confrontato i profili di espressione genica delle popolazioni timocitarie con la lista di target predetti computazionalmente per i miR regolati con maggiore fold-change nel corso della differenziazione dei timociti da DP a SP. Combinando quest’ultimo approccio alla ricerca bioinformatica integrata di target, abbiamo identificato un gene della famiglia dei recettori Notch (Notch3), definito Candidate Target 1, che è noto giocare un ruolo importante nella differenziazione T e nella trasformazione leucemica e che viene predetto, in modo concorde da tre diversi software di predizione di target, come bersaglio di miR-150, uno dei miR maggiormente up-regolati nelle popolazioni timocitarie mature rispetto ai DP. Inoltre, il trascritto di Candidate Target 1 risulta regolato in modo opposto al miR-150 nel passaggio dei timociti dallo stadio DP a quello di SP CD4. In particolare, abbiamo identificato un'elevata complementarietà fra il miR-150 e l'UTR-3' del gene Candidate Target 1. Attualmente stiamo lavorando per validare sperimentalemente l’associazione fra miR-150 e Candidate Target 1. In parallelo, abbiamo deciso di studiare gli effetti funzionali dell’over-espressione di miR-150 in linee cellulari di T-ALL. MiR-150 è espresso a livelli molto bassi in tutte le linee cellulari di T-ALL analizzate. Inducendo l’espressione forzata di miR-150 nella linea di T-ALL Jurkat, abbiamo osservato un significativo rallentamento del tasso di proliferazione cellulare associato ad un accumulo delle cellule in fase G2. Infine, allo scopo di identificare pattern di espressione dei miR associati alla trasformazione neoplastica T, abbiamo confrontato i profili d’espressione dei miR delle sottopopolazioni timocitarie umane con il proflo di un gruppo di linfomi linfoblastici T (T-LBL) pediatrici ed un gruppo di linfonodi reattivi non neoplastici (LN) (forniti dal laboratorio del Dott. Rosolen, Dipartimento di Pediatria, Università di Padova). Il clustering gerarchico dei campioni ha mostrato che i T-LBL hanno un profilo d’espressione dei miR distinto sia da quello delle sottopopolazioni timocitarie, sia da quello dei linfonodi reattivi. Abbiamo inoltre osservato che tutti i 25 miR maggiormente regolati nel passaggio dei timociti dallo stadio DP a SP (a parte miR-128) risultano espressi in modo differenziale nei T-LBL rispetto ad almeno una delle popolazioni timiche. Nel futuro, ci proponiamo di investigare il significato biologico di alcuni dei miR regolati nella maturazione e la trasformazione neoplastica delle cellule T, ponendo particolare attenzione al ruolo di miR-150 in questi processi.