Glycogenosys type II and Danon Disease: molecular study and muscle pathology

Scopo di questo studio è stato quello di analizzare a livello molecolare, biochimico e della patologia muscolare due gruppi di pazienti affetti dalla malattia di Danon e da glicogenosi di tipo II, in modo da acquisire nuove informazioni utili a tracciare possibili correlazioni genotipo-fenotipo e a chiarire i meccanismi patologici alla base di queste patologie. La Glicogenosi di tipo II (GSDII) è una malattia autosomica recessiva (OMIM # 232300) causata da un deficit dell’enzima mitocondriale ?-glucosidasi o maltasi acida (EC 3.2.1.20/3), che catalizza l’idrolisi dei legami glicogeno ? -1,4 e ? -1,6. Tale deficit enzimatico porta all’accumulo a livello lisosomale di glicogeno, che genera un’ampia eterogeneità clinica, che spazia da casi con esordio infantile e quadro clinico molto severo a forme più benigne con esordio tardivo nell’età adulta. Sono stati analizzati 23 pazienti con deficit di ?-glucosidasi acida per l’attività enzimatica mediante saggio fluorimetrico, l’espressione proteica mediante immunoblotting, la presenza di mutazioni nel gene GAA con SSCP e la patologia muscolare mediante immunocolorazione del Golgi e delle proteine sarcolemmali. L’attività enzimatica è risultata assente o minima nei casi ad esordio infantile e variabilmente ridotta nei pazienti con esordio tardivo. Le correlazioni genotipo-fenotipo indicano che la maggior parte dei pazienti ad esordio tardivo presentano la mutazione “leaky splicing” c.–32-13T>G in eterozigosi (un paziente era omozigote), ma il decorso della malattia è spesso difficile da prevedere solo sulla base delle mutazioni. Un risultato interessante deriva dall’analisi mediante western blot dell’espressione dell’?-glucosidasi nei pazienti: abbiamo infatti dimostrato che il muscolo di questi pazienti esprime prevalentemente forme inattive/immature dell’enzima ?-glucosidasi, mentre la forma matura della proteina è assente o presente a livelli molto ridotti. Inoltre, si è visto che l’eventuale quantità residua di forme proteiche mature riscontrate al western blot correla con i livelli di attività enzimatica riscontrati nel muscolo di questi pazienti. Il peso molecolare sia delle forme mature che di quelle immature/inattive è risultato essere maggiore nei pazienti rispetto ai muscoli di controllo. Attribuiamo tali differenze ad un’eccessiva sialilizzazione delle forme proteiche non funzionali, causata probabilmente da un loro trasporto ritardato o da una loro ritenzione nel complesso di Golgi, in cui agiscono le sialil-transferasi. A sostegno di tale ipotesi, abbiamo riscontrato una proliferazione del Golgi nelle fibre muscolari dei pazienti, causata possibilmente dalla ritenzione delle forme enzimatiche inattive, che non possono venire correttamente veicolate ai lisosomi. Le membrane vacuolari esprimono le proteine sarcolemmali nei pazienti con esordio tardivo ma non in quelli ad esordio infantile, suggerendo un’autofagia estesa ed un rimodellamento della membrana vacuolare nei pazienti ad esordio tardivo. La Malattia di Danon ha ereditarietà di tipo dominante legato al cromosoma X ed è causata da mutazioni nel gene LAMP2 (Lysosomal Associated Membrane Protein-2), e si presenta con cardiomiopatia ipertrofica, miopatia e ritardo mentale. Per studiare gli effetti delle mutazioni nel gene LAMP2 sull’espressione proteica in diversi tessuti, abbiamo effettuato uno screening molecolare ed un’analisi del difetto proteico sul tessuto muscolare, cardiaco, sui leucociti e fibroblasti di 9 soggetti maschi non correlati tra loro, con cardiomiopatia ipertrofica e miopatia vacuolare. Tre dei 9 soggetti analizzati hanno evidenziato un deficit proteico di LAMP2 generalizzato. Tale difetto è stato infatti riscontrato in tutti i tessuti da noi analizzati: tessuto muscolare scheletrico e cardiaco, leucociti e fibroblasti. Questo risultato indica che l’analisi biochimica può essere svolta in modo non invasivo sui leucociti, e potrebbe quindi essere impiegata nello screening dei soggetti maschi; inoltre, questo deficit multi-organo di proteina LAMP2 potrebbe spiegare il coinvolgimento clinico multisistemico. Abbiamo inoltre esteso l’analisi anche alla madre di un affetto: in questo caso il muscolo, i fibroblasti e i leucociti presentano livelli proteici comparabili al controllo normale. Sono state identificate mutazioni nel gene LAMP2 in tutti e 3 i pazienti maschi e nella femmina eterozigote. Ciascun paziente presentava una mutazione diversa e non riportata precedentemente in letteratura: sono tutte mutazioni nulle (nonsenso o frame-shifting) che ci si aspetta diano origine ad una proteina tronca, con perdita del dominio trans-membrana. ’istopatologia muscolare ha evidenziato una vacuolizzazione fibrale estesa e della degenerazione . L’analisi immunopatologica del muscolo scheletrico ha evidenziato che non vi è proliferazione del complesso del Golgi nei pazienti, che le membrane vacuolari esprimono le proteine sarcolemmali e che il grado di vacuolizzazione correla con il coinvolgimento clinico a livello muscolare. L’analisi dell’inattivazione del cromosoma X effettuata sul tessuto muscolare e sui leucociti ha escluso la possibilità che il coinvolgimento selettivo di alcuni tessuti nelle femmine sia dovuto ad una inattivazione non casuale dell’X