In silico analysis of membrane transport/permeability mechanisms

Le membrane lipidiche sono una componente fondamentale delle cellule viventi, separano fisicamente le componenti intracellulari dall’ambiente esterno e i diversi organelli del citoplasma. Le proteine di trasporto conferiscono permeabilità alle membrane lipidiche, proprietà essenziale per la traslocazione di nutrienti e la conservazione dell’energia. La cristallografia di proteine transmembrana è problematica a causa della loro localizzazione e proprietà chimiche, e solo un numero piuttosto ridotto di strutture è disponibile. L’analisi in silico può essere applicata con successo per investigare le strutture e il funzionamento proporre modelli testabili di trasportatori e delle loro funzioni. Il lavoro del mio dottorato sì è focalizzato su due modelli: la pendrina (SLC26A4) e il poro di transizione di permeabilità (PTP). Questi due sistemi proteici mi hanno permesso di studiare due differenti tipi di membrana e meccanismi di permeabilità: la membrana plasmatica con scambio specifico di anioni (SLC26A4) e la membrana interna mitocondriale con la permeabilità non selettiva mitocondriale (PTP). Le mutazioni della pendrina sono stimate essere la seconda causa genetica più comune della sordità umana, ma la struttura della proteina non è stata ancora determinata. Scopo del mio lavoro è stato quello di sopperire all’assenza di informazioni strutturali per il dominio transmembrana della pendrina e di dare una spiegazione funzionale per le mutazioni raccolte nel MORL Deafness Variation Database. Il modello 3D della pendrina è basato sull’omologia con SLC26Dg (3) ed è stato validato analizzando la distribuzione sulla superfice dei residui idrofobici. L’alta qualità risultante dal modello è stata usata per mappare 147 mutazioni patologiche umane. Tre cluster di mutazioni sono stati trovati e la loro localizzazione suggerisce per pendrina un innovativa struttura a 14 domini transmembrana. Anche la natura del PTP è rimasta a lungo misteriosa. Nel 2013 Giorgio et al. hanno suggerito che i dimeri di F1FO (F)-ATP sintasi formino il poro, tuttavia l’esatta composizione e il modo in cui il poro di transizione si possa formare è ancora materia di dibattito. L’apertura del PTP è innescata da un aumento della concentrazione di Ca2+ nella matrice mitocondriale ed è favorita dallo stress ossidativo. Per fare luce sul funzionamento del PTP ho studiato l’effetto del legame del Ca2+ al sito per i cationi divalenti (Me2+) nel dominio F1 attraverso la dinamica molecolare (MD). Un approccio simile è stato anche applicato alla mutazione T163S, che fa variare l’affinità relativa per Mg2+ e Ca2+. I dati sperimentali mostrano come la mutazione induca resistenza all’apertura del PTP. La MD ha dimostrato come il legame del Ca2+ irrigidisca la struttura del complesso. Il riarrangiamento del sito catalitico indotto dai differenti ioni che lo occupano, così come la mutazione T163S, causa rilevanti variazioni delle interazioni tra il dominio F1 e la subunità OSCP. Suggerisco che un loop non strutturato tra i residui 82-131 della subunità β trasmetta il riarrangiamento strutturale originato nel sito catalitico a OSCP e quindi alla membrana interna attraverso il rigido stalk laterale. Il ruolo critico che emerge per OSCP nella regolazione del PTP apre due domande collegate: (i) come il segnale di apertura mediato da OSCP venga trasmesso alla regione trans-membrana e (ii) quali siano i componenti transmembrana del PTP. Le variazioni di conduttanza del poro osservate in specie diverse suggeriscono che le subunità che formano il canale debbano avere delle differenze significative. E’ stato prodotto un allineamento di sequenze per tutte le subunità della F-ATP sintasi. I risultati preliminari ci hanno spinto a focalizzarci sulle subunità e, g e b a causa della loro localizzazione e conservazione di sequenza. Basandomi sugli allineamenti multipli ho suggerito mutazioni puntiformi per testare l’importanza di specifici residui ai fini dell’apertura del poro. In parallelo la presenza delle subunità e e g tra gli eucarioti è stata indagata attraverso un analisi filogenetica. Proteine omologhe di queste specifiche subunità sono presenti in tutti gli eucarioti: dai lieviti alle piante, tuttavia gli Oomiceti sono risultati mancanti delle subunità e e g e le alghe verdi della subunità e. Questi risultati suggeriscono un’origine antica per le subunità di dimerizzazione della F-ATP sintasi e probabilmente anche del PTP. Per chiarire questo aspetto saranno necessarie ulteriori analisi e verifiche sperimentali.