New insights into S. cerevisiae F-ATP synthase and its role in the mitochondrial permeability transition

Il poro di transizione della permeabilità (PTP) è stato caratterizzato nei mammiferi come un canale mitocondriale attivato dal Ca2+ la cui apertura permette ai soluti con un peso molecolare inferiore a 1.5 kDa di equilibrarsi attraverso la membrana, causando eventualmente il rigonfiamento della matrice, la rottura della membrana esterna e il rilascio di fattori pro-apoptotici. Oltre al Ca2+, l’apertura del PTP è favorita, soprattutto, dallo stress ossidativo, dalla depolarizzazione della membrana interna e dal Pi; al contario, tra i principali “desensitizzatori” fisiologici troviamo i nucleotidi adeninici, il Mg2+ e un pH acido di matrice. Finora sono stati scoperti alcuni composti con un effetto antagonista al canale, come, per esempio, la ciclosporina A (CsA) e alcuni derivati, scoperti nel nostro laboratorio, che prevengono il legame della ciclofilina D, un potente induttore del poro. Se il PTP sia o meno una caratteristica mitocondriale conservata nel lievito è stato un quesito lungamente dibattuto. Diversi studi suggeriscono che i mitocondri di lievito presentano vari pathways indipendenti di permeabilità con caratteristiche e modulazione peculiari, includendo un pathway attivato dall’ATP, probabilmente atto a dissipare l’eccesso di energia. Inoltre, il PTP di lievito risulta essere inibito piuttosto che attivato dal Pi, insensibile alla CsA, mentre la dipendenza dal Ca2+ è stata difficile da verificare, data l’assenza di un uniporto mitocondriale del Ca2+. Nell’articolo pubblicato recentemente (vedi Pubblicazione 1), abbiamo confermato l’esistenza di un PTP attivato da Ca2+ in S.cerevisiae, com’era stato suggerito in precedenza da Shinohara e collaboratori, utilizzando lo ionoforo del Ca2+, ETH129, che permette l’accumulo elettroforetico del Ca2+ esogeno aggiunto durante esperimenti di capacità di retenzione del Ca2+ (CRC). I nostri dati mostrano che il PTP di lievito è fortemente sensibile a composti che agiscono sui tioli liberi come la phenylarsine oxide, copper-o-phenantroline e la diamide, riconosciuti attivatori del PTP mammifero, e che questo effetto può essere contrastato e ripristinato da agenti riducenti. Inoltre, abbiamo geneticamente dimostrato che CPR3, l’omologo di lievito della ciclofilina D di mammifero, non esercita alcun ruolo nella regolazione del PTP, spiegando quindi la mancata sensibilità del poro alla CsA. Nel 2013, il nostro laboratorio ha proposto un nuovo modello per il PTP di mammifero, attribuendo all’enzima F-ATP sintasi, nello specifico alla struttura dimerica, un ruolo chiave. Per verificare che questa caratteristica sia conservata anche nel lievito, abbiamo isolato dimeri attivi di F-ATP sintasi attraverso una Blue-Native PAGE e li abbiamo utlizzati in esperimenti di elettrofisiologia (planar lipid bilayer). I nostri dati dimostrano che i dimeri di F-ATP sintasi di lievito formano un canale attivato dal Ca2+ e da ossidanti, con un tipico comportamento di “flickering”, molto simile a quello osservato nel poro di mammifero, anche se con un valore di conduttanza minore, di circa 250-300 -pS. Inoltre, l’attività del canale è inibita da ADP e Mg2+, come riscontrato anche nel mammifero. Questi dati evidenziano che le proprietà di formazione del PTP si sono conservate durante l’evoluzione. Per confermare ulteriormente questo ruolo dei dimeri, abbiamo analizzato mutanti deleti per due piccole subunità accessorie (e o TIM11, g o ATP20) coinvolte della dimerizzazione dell’enzima. I singoli mutanti come anche il doppio deleto, mostrano chiari difetti nella formazione di dimeri nella BN-PAGE e un incremento sensibile della CRC rispetto al controllo. Comunque, dopo trattamento con CuCl2, che produce ponti disolfuro tra tioli vicini, è possibile rintracciare, nei mutanti, la formazione di dimeri, motivo per cui l’apertura del PTP non è completamente prevenuta. Da esperimenti preliminari di elettrofisiologia condotti con questi dimeri cross-linkati, appare evidente che la conduttanza del canale diminuisce drasticamente (circa 30 -pS) rispetto a quella misurata nel wild-type, supportando l’ipotesi che le subunità e, g possano essere proteine chiave nella formazione del PTP. Per identificare il residuo target del CuCl2, che potrebbe avere un ruolo rilevante nella stabilizzazione del dimero nonché del canale, abbiamo condotto degli esperimenti di mutagenesi delle cisteine presenti nelle subunità dell’enzima in un background genetico di doppia delezione per e,g. Dall’analisi in gel nativo, abbiamo scoperto che il mutante per la cisteina 23 della subunità a (ATP6) non forma dimeri dopo trattamento con CuCl2, indicando che il residuo in questione è effettivamente il target di questa ossidazione e che probabilmente media ponti disolfuro tra monomeri adiacenti, stabilizzando l’enzima. Un’altro importante risultato ottenuto dallo screening riguarda la cisteina di OSCP, una subunità del gambo laterale dell’F-ATP sintasi, che appare mediare l’effetto inducente della diamide sul poro. Infatti, i mutanti mancanti la cisteina 23 sono meno sensibili alla diamide, almeno a basse concentrazioni. In conclusione, questi risultati rappresentano la prima dimostrazione che i dimeri di F-ATP sintasi di lievito formano un canale ad alta conduttanza analogo al PTP di mammifero e che quindi la formazione del canale è una proprietà conservata delle F-ATP sintasi. Cercheremo quindi di sbrogliare i tanti punti oscuri riguardo la struttura a la regolazione del PTP, sfruttando i potenti metodi di genetica disponibili nel lievito.