Ruolo prognostico dei tumor associated macrophages e del rapporto linfociti/monociti su sangue periferico alla diagnosi nel linfoma di Hodgkin

RIASSUNTO 1. INTRODUZIONE Il Linfoma di Hodgkin (HL) è una malattia rara e rappresenta circa il 5% di tutte le neoplasie maligne e l'11% di tutti i linfomi. Il linfoma di Hodgkin classico è istologicamente caratterizzato dalla presenza di cellule giganti multinucleate chiamate cellule di Hodgkin e cellule di Reed-Sternberg, che rappresentano la minoranza rispetto a tutta la popolazione cellulare presente nel linfonodo (circa 1% a 5%) e sono circondate da un microambiente reattivo polimorfico costituito da linfociti, plasmacellule, neutrofili, eosinofili, mastociti, macrofagi, cellule stromali e fibroblasti. I trattamenti più moderni sono in grado di curare circa l'80% dei pazienti con linfoma di Hodgkin. Poiché la malattia si presenta nei giovani adulti (15-35 anni), c'è una lunga aspettativa di vita e quindi il progressivo incremento dei tassi di guarigione deve inoltre tener conto dell'importanza vitale di un lungo periodo di follow-up. I principali fattori prognostici includono: massa bulky mediastinica, sintomi B, più di 3 stazioni linfonodali coinvolte e VES> 50 mm / h. Uno studio multicentrico da Hasenclever et al. nel 1998 ha individuato sette fattori prognostici per la malattia in stadio avanzato (International Prognostic Score, IPS): età ≥ 45, sesso maschile, albumina <40 g / l, emoglobina <105 g / l, stadio, leucocitosi ≥ 15.000 per mm3, linfopenia. Una valutazione precoce della risposta misurata da una PET intermedia ha dimostrato di essere un potente strumento prognostico indipendente da fattori clinici e biologici, compreso l’IPS. Tuttavia, attualmente, almeno il 20% dei pazienti recidiva e una percentuale simile viene sovra trattata. La interim PET ha un valore clinico solo dopo i trattamenti con schema ABVD mentre il punteggio IPS è valido solo per la malattia in fase avanzata. Alcuni autori hanno segnalato un impatto prognostico dei Tumor Associated Macrophages (TAM) e del rapporto linfociti / monociti nel sangue periferico alla diagnosi nel Linfoma di Hodgkin Classico. Gli studi condotti fino ad ora forniscono risultati contrastanti e le analisi sono spesso basate su popolazione non omogenee di pazienti. Da qui la necessità di nuovi marcatori prognostici e predittivi alla diagnosi per un migliore trattamento della patologia. 2. SCOPO DELLO STUDIO Obiettivo dello studio è stato l'identificazione di nuovi marcatori prognostici al momento della diagnosi di linfoma di Hodgkin in base al valore assoluto del rapporto linfociti / monociti (LMR) nel sangue periferico, la quantità di TAM e la micro vessel density (MVD) nel tessuto neoplastico ottenuti al momento della diagnosi. End-point primario dello studio era il valore prognostico di LMR e TAM in termini di sopravvivenza libera da eventi (EFS). Abbiamo anche correlato la fase di presentazione alla diagnosi suddivisa in precoce (stadio IA, IB, IIA senza lesioni bulky) e avanzato (stadio IIB, III, IV) con LMR, TAM e MVD. 3. MATERIALI E METODI Abbiamo preso in considerazione tutti i pazienti con nuova diagnosi di linfoma di Hodgkin trattati presso l'Istituto Oncologico Veneto da gennaio 2004 ad aprile 2015. Abbiamo anche analizzato tutti i pazienti affetti da LH trattati nello stesso periodo presso il Dipartimento di Oncologia di Vittorio Veneto e Bassano del Grappa. Tutti i pazienti (n = 143) sono stati valutati per LMR mentre abbiamo effettuato le indagini immunoistochimiche (IHC) solo su 60 campioni escludendo tutti i casi con biopsie diagnostiche inferiori a 1 cm. La percentuale di TAM è stata determinata mediante immunoistochimica con un anticorpo monoclonale anti-CD68 mentre la MVD è stata determinata con l'anticorpo antiCD105. La percentuale di cellule positive per CD68 è stata valutata in relazione alla cellularità generale: in base a questo valore, i pazienti sono stati divisi in tre gruppi: <5% (bassa espressione, score 1), 5-25% (espressione intermedia, pscore 2) e > 25% (alta espressione, score 3). La risposta al trattamento è stata valutata con TAC intermedia e PET al termine del trattamento. I pazienti trattati con schema ABVD ricevevano una rivalutazione precoce con l’esame PET dopo 2 cicli di cura. 4. ANALISI STATISTICA Le curve ROC (Receiver Operating Characteristics) sono state utilizzate per determinare il cutoff ottimale di ALC (conta assoluta linfocitaria), AMC (conta assoluta monocitica) e LMR. Il rapporto tra linfociti, monociti, ratio linfociti/monociti e EFS è stato valutato con un’analisi univariata mediante Regressione di Cox. I risultati dell’analisi immunoistochimica sono stati correlati alle recidive/progressioni osservate e allo stadio di malattia, diviso in precoce e avanzato:per queste analisi sono stati utilizzati rispettivamente il Test di Mann-Whitney e la regressione logistica. Valori di p inferiori a 0,05 sono considerati significativi. Per l'analisi della sopravvivenza, endpoint primario era l’EFS, definito come il tempo dal primo giorno di trattamento fino alla progressione della malattia, recidiva, o morte per qualsiasi causa o data dell’ultimo follow-up Le curve di sopravvivenza sono state calcolate con il metodo di Kaplan- Meier. La significatività statistica è stata definita come valore di p <0,05. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con il software SPSS Statistics 2.0. 5. RISULTATI L'età media alla diagnosi era di 38 anni con 77 maschi e 66 femmine. Il follow up è stata di 40 mesi (range 5-120). 126 pazienti hanno ricevuto una diagnosi di linfoma di Hodgkin classico, 95 di questi (67%) avevano un istotipo a sclerosi nodulare, 20 (14%) a cellularità mista, 11 (7%) lymphocyte depleted. Infine, 17 (12%) pazienti erano affetti da linfoma di Hodgkin a prevalenza linfocitaria nodulare. 58 pazienti (41%) presentavano malattia in stadio limitato e 85 (59%), in stadio avanzato. 21 (15%) avevano lesioni bulky. L’IPS è stato calcolato per tutti gli 85 pazienti in stadio avanzato: in base a questo indice prognostico abbiamo individuato 15 pazienti (18%) con malattia a basso rischio (IPS 0-1) , 65 pazienti (76%) con malattia a rischio intermedio (IPS 2-3) e 5 pazienti (6%) con malattia ad alto rischio (IPS 4-7). 139 pazienti hanno ricevuto trattamento chemioterapico con i seguenti schemi: ABVD (in 106 casi), STANFORD V (in 23 casi), escalatedBEACOPP (in 8 casi), mentre due pazienti anziani considerati fragili ad una valutazione geriatrica multidimensionale hanno ricevuto solo trattamento palliativo con procarbazina in monoterapia. Quattro pazienti con Linfoma di Hodgkin a prevalenza linfocitaria nodulare in stadio IA hanno ricevuto solo trattamento radiante. 86 dei 106 pazienti trattati secondo schema ABVD, hanno eseguito una rivalutazione attraverso PET dopo 2 cicli di terapia (PET 2). L'indagine ha fornito una remissione completa (CR) in 65 pazienti e una remissione parziale (PR) in 21 pazienti. Dei 65 pazienti con PET2 negativa , 8 hanno presentato in seguito una recidiva (12%), mentre, tra i 21 pazienti con PET 2 positiva , 11 hanno mostrato recidiva (52%), dieci dei 21 pazienti con PET 2 negativa hanno ottenuto una remissione completa dopo la fine del trattamento e sono attualmente vivi e senza evidenza di malattia. La nostra esperienza conferma l'importante valore prognostico della PET 2 dopo il trattamento secondo schema ABVD. 91 su 106 (85%) pazienti trattati con il regime ABVD hanno presentato recidiva o progressione di malattia, 20 dei 23 (87%) pazienti trattati con STANFORD V hanno avuto recidiva di malattia mentre tutti i pazienti (8 su 8) trattati con lo schema escalatedBEACOPP hanno ottenuto remissione completa. Un paziente ha sviluppato leucemia mieloide acuta un anno dopo la fine del trattamento con escalatedBEACOPP. 90 su 143 pazienti hanno ricevuto un trattamento di consolidamento con radioterapia involved-field alla dose di 30 Gy o 36 Gy sulle lesioni bulky. In totale 123 pazienti hanno avuto un quadro di remissione completa al termine della terapia di prima linea, 2 remissione parziale e 18 sono progrediti alla fine del trattamento di prima linea. 18 dei 123 pazienti in CR alla fine della terapia di prima linea hanno sperimentato recidiva. 35 pazienti hanno ricevuto una terapia di seconda linea ottenendo una remissione completa in 23 casi. 11 pazienti sono morti: in 8 casi la morte si è verificato a causa della progressione della malattia; in un caso la morte è invece correlata allo sviluppo di un secondo tumore (leucemia mieloide acuta dopo chemioterapia secondo schema ABVD con RC alla fine del trattamento per linfoma); in due casi i pazienti sono morti per infarto miocardico acuto successivo a chemioterapia con schema ABVD. Ad un follow-up medio di 40 mesi, non è stata raggiunta la EFS mediana. Il valore medio dei linfociti era 1.530 per mm3 con una mediana di 1350 per mm3 (range 330-9700). Il valore medio di monociti è stato di 720 per mm3 con una mediana di 610 per mm3 (range 70-2570). Il rapporto linfociti / monociti medio è stato di 3,58. Sono state eseguite le curve ROC per l’ EFS in relazione alla conta assoluta dei linfociti (ALC), alla conta assoluta dei monociti (AMC) e al LMR. L'area sotto la curva (AUC) per ALC aveva un valore di 0,61 (95% CI, 0,468 a 0,752), per AMC è risultata di 0,512 (95% CI, 0.358 a 0.666), mentre per il rapporto ALC / AMC era 0,558 (95% CI, 0,408-0,707). Per nessuna di queste variabili è stata evidenziata una relazione statisticamente significativa con l’EFS dei pazienti. Abbiamo poi correlato ALC, AMC e LMR con EFS utilizzando la regressione di Cox. L’Hazard ratio (HR) per ALC era 1.149 con un valore p di 0,464, per AMC, HR era 1.103 con un valore p di 0,855. Infine per LMR, HR era uguale a 1.035 con un valore p di 0,086, non evidenziando correlazioni statisticamente significative. Abbiamo anche verificato la presenza di una possibile associazione tra la fase di presentazione della malattia e ALC, AMC, LMR. Da questo, il rapporto linfociti / monociti sembra essere correlato con lo stadio di presentazione alla diagnosi (p = 0,035). In particolare il valore di ALC / AMC in pazienti con stadio avanzato è più basso (1,86) rispetto al valore osservato nei pazienti con stadio limitato (2,71). L'analisi immunoistochimica ha mostrato positività per CD68 ≤ 5% in 20 casi, tra il 5 e il 25% in 26 casi e ≤ 25% in 14 pazienti. Per la positività al CD 105 abbiamo osservato una maggiore variabilità con una media di positività del 15% (range 5% -30%). Abbiamo valutato la possibile correlazione tra la positività per CD68 e le recidive / progressioni osservate, non evidenziando nessuna differenza fra i tre sottogruppi. Allo stesso modo, si è cercato di correlare la positività per CD105 con le recidive / progressioni. Anche in questo caso non vi sono state differenze statisticamente significative. Infine, abbiamo verificato la presenza di una possibile associazione tra lo stadio della malattia, distinto in limitata e avanzata, e la percentuale di CD68 e CD105 rilevato nella biopsia diagnostica. Anche in questo caso non abbiamo trovato alcuna correlazione statisticamente significativa. Non sono state evidenziate associazioni tra lo stato della PET 2 e la percentuale di TAM e il LMR riscontrati. 6. DISCUSSIONE Lo studio di Steidl del 2010 ha aperto una nuova prospettiva per la stratificazione del rischio nei pazienti con linfoma di Hodgkin: a partire dall’evidenza del ruolo importante dei macrofagi nel processo di interazione tra le cellule tumorali e il microambiente circostante, Steidl ha ipotizzato la presenza di un possibile significato prognostico della quantità dei macrofagi CD68 + presenti nella lesione neoplastica primitiva. Attraverso lo studio dei profili di espressione genica eseguiti su campioni bioptici di 130 pazienti affetti da linfoma di Hodgkin ottenuti al momento della diagnosi e poi confermati in una coorte indipendente di 166 pazienti, Steidl ha mostrato una forte associazione tra l’aumentata espressione di TAM con la riduzione della sopravvivenza libera da progressione (PFS) e la sopravvivenza malattia-specifica (DSS). Studi successivi tuttavia, hanno riportato dati contrastanti. La nostra esperienza non sembra mostrare alcun rapporto tra l'infiltrazione di macrofagi e l’outcome dei pazienti. I TAM sembrano avere un ruolo fondamentale nella progressione tumorale modulando il sistema immunitario, l'angiogenesi e la metastatizzazione cellulare. Alcuni studi hanno dimostrato che i macrofagi producono VEGF-A, un fattore di crescita per l'endotelio vascolare, e metalloproteinasi della matrice 9 (MMP9), che facilita il rilascio di VEGF dalla matrice extracellulare promuovendo così l’angiogenesi. Dati di letteratura indicano che CD105 (Endoglina), una proteina indotta dall’ipossia e parte integrante del complesso proteico del recettore per TGF-β, è abbondantemente espressa sulle cellule endoteliali dei neovasi dei tessuti tumorali; anche, la densità dei vasi neoformati nei tessuti neoplastici (MVD, intratumorale densità dei microvasi), determinata utilizzando l’anticorpo anti- CD105, è stata identificato come un fattore prognostico indipendente per la sopravvivenza in alcuni tumori solidi e neoplasie ematologiche. Il nostro studio ha valutato per la prima volta la presenza di una possibile associazione tra l'MVD e la recidiva / progressione della malattia utilizzando l'anticorpo anti CD105. Anche in questo caso non vi erano correlazioni statisticamente significative. Porrata et al. hanno collegato la conta linfocitaria assoluta e la conta dei monociti alla diagnosi con l’outcome clinico dei pazienti con linfoma di Hodgkin.. Questo studio ha dimostrato che i pazienti con un AMC ≥ 900 cellule / L hanno una sopravvivenza inferiore rispetto a quelli con un basso livello di monociti del sangue periferico; ALC ha influenza non solo sulla sopravvivenza globale (OS) e libera da progressione (FFP), come dimostrato dallo studio di Hasenclever, ma anche sulla sopravvivenza specifica per linfoma (LSS). Un LMR ≥ 1.1 si associa ad una maggiore OS, LSS, PFS e tempo alla progressione in tutti gli stadi della malattia (sia limitato che avanzato). Anche nel nostro lavoro vi è una relazione statisticamente significativa tra il rapporto ALC / AMC e la fase di presentazione al momento della diagnosi; non ci sono relazioni statisticamente significative, tuttavia, tra ALC / AMC e EFS.