The role of omega-3 PUFA-enriched diet and DHA metabolites derived from aspirin-acetylated COX-2 on tumor growth and angiogenesis.

Background: Il tumore alla mammella (TM) è il tumore più frequente che si verifica nelle donne. Dati epidemiologici hanno collegato l’assunzione degli acidi grassi polinsaturi omega-3 (n-3 PUFA) con la minore incidenza di TM e diversi studi sperimentali hanno dimostrato gli effetti anti-proliferativi di n-3 PUFA in diversi modelli di TM. L’olio di chia è ricco di acido alfa-linolenico (ALA, 18:3 n-3), mentre l'olio di mais è ricco di acido linoleico (LA, 18:2 n-6). L'angiogenesi è un processo strettamente regolato che coinvolge la proliferazione, la migrazione e la formazione di capillari da parte delle cellule endoteliali (CE). L’acido docosaesaenoico (DHA, 22:6 n-3), un metabolita a valle dell’ALA, è stato dimostrato essere in grado di regolare l'angiogenesi correlatea al tumore, mentre l'acido arachidonico (AA, 20:4 n-6) promuove l'angiogenesi. Inoltre, l'aspirina (ASA) ha effetti antineoplastici che sono mediati, almeno in parte, da metaboliti derivati dall’acetilazione della COX-2. Lo scopo dello studio è stato quello di determinare il ruolo degli n-3 PUFA sulla crescita del un tumore alla mammella e, in particolare, di valutare l'effetto di metaboliti derivati dalla COX-2 acetilata in presenza di DHA nell'angiogenesi. Metodi: 40 topi BALB/c sono stati nutriti con 1) una dieta ricca di n-3 PUFA contenente il 10% di olio di chia (ChO); o 2) una dieta ricca d n-6 PUFA contenente il 10% d’olio mais (CO). In seguito, i topi sono stati inoculati con una linea di cellule tumorali (LM3) per indurre il tumore primario ed i parametri di crescita tumorale sono stati registrati dopo 45 giorni. Nelle sezioni di tessuto tumorale sono state valutate le cellule mitotiche ed apoptotiche e l'angiogenesi mediante immunoistochimica. Gli esperimenti in vitro sono stati condotti con cellule endoteliali umane (HUVECs). Le HUVECs sono state trattate con DHA o AA (1-100 microM) per diversi tempi in presenza o assenza di ASA (50 microM). Inoltre, alcuni esperimenti sono stati effettuati con 17R-HDHA (100 nM – 3 microM), un metabolita derivato dalla COX-2 acetilata in presenza di DHA. La produzione endogena di 17R-HDHA da parte delle HUVECs è stata analizzata mediante spettrometria di massa. La citotossicitá dei composti è stata valutata con il test MTT. La capacità angiogenica delle HUVECs è stata valutata utilizzando a) il saggio della chiusura della ferita, b) la chemiotassi in camera di di Boyden e c) la formazione dei capillari con il saggio di matrigel. Risultati: Dopo 45 giorni l'incidenza tumorale era più alta nei topi sottoposti a dieta con olio di mais (CO) rispetto a quelli alimentati con la dieta chia (ChO) (100 vs 85%, p <0.05). Il peso tumorale ed il volume del tumore, così come il numero delle metastasi erano più bassi nei topi che avevano ricevuto la dieta ChO, mentre il tempo di latenza del tumore è risultato più lungo nei topi alimentati con la dieta ChO. Inoltre, nel gruppo di topi sottoposti a dieta ChO sono state osservateun maggior numero di cellule apoptotiche, un minor numero di cellule mitotiche cosí come un minor numero di vasi rispetto al gruppo di controllo (CO). Alla luce di questi risultati in vivo, abbiamo studiato se n-3 PUFA avevano attivitá anti-angiogenica diretta sulle CE umane. Non abbiamo osservato variazioni nella vitalità delle cellule endoteliali trattate con DHA fino a 50 microM o AA, in presenza o assenza di ASA per 24h, cosí come nelle cellule trattate con 17R-HDHA. La migrazione delle CE valutata mediante il saggio di chiusura della ferita, è significativamente diminuita rispetto al controllo nelle cellule pretrattate per 24 ore con 30 microM DHA, ma non in quelle pretrattate con 10 microM DHA. Tuttavia, è interessante sottolineare che 10 microM DHA in presenza di 50 microM ASA ha inibito significativamente la migrazione delle CE (-36%±5.4%, p<0.001) già dopo 24 ore. Per contro, AA in presenza o assenza di ASA non ha influenzato la migrazione cellulare a nessuna delle concentrazioni valutate (1-30 microM). In linea con questi risultati, le HUVECs trattate con DHA in presenza d’ASA ha prodotto una maggiore quantità di 17R-HDHA rispetto alle cellule trattate con solo DHA. Inoltre, il pretrattamento per 24h con 17R-HDHA (1-3 microM) ha diminuito la migrazione delle cellule endoteliali valutata con il test di chiusura della ferita (-12%±4.1% and -28%±1.9%, p<0.05 e p<0.01, rispettivamente). Inoltre, 17R-HDHA (300 nM, 1-3 microM per 6 ore) ha ridotto la migrazione cellulare valutata in una camera di chemiotassi (-20%±1.4%, -30%±4.0% and -65%±3.5%, p<0.01 e p<0.001, rispettivamente), mentre DHA da solo non ha mostrato alcun effetto. Inoltre, 17R-HDHA ha diminuito la formazione di strutture capillaro-simili dopo 6 ore. In particolare, valutando diversi parametri, si è visto che i nodi, le maglie e la zona delimitata dalle maglie erano significativamente più bassi nelle cellule trattate con 10 microM DHA in presenza di 50 microM ASA, così come in quelle cellule trattate con 17R-HDHA (300 nM - 3 microM). Conclusione: i risultati in vivo in un modello murino di tumore al seno, mettono in luce un ruolo degli n-3 PUFA nella crescita tumorale. I risultati in vitro dimostrano che l’acetilazione della COX-2 da parte dell’aspirina porta alla produzione di metaboliti che potenziano gli effetti anti-angiogenici di DHA e possono avere un ruolo nel tumore.