CARATTERIZZAZIONE GENETICA E FUNZIONALE DI FIBROBLASTI ISOLATI DA PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME DI ALSTROM

La Sindrome di Alström (ALMS) è una malattia genetica autosomica recessiva estremamente rara (circa 560 casi descritti nel mondo) causata da mutazioni del gene ALMS1, e caratterizzata da diversi quadri sintomatologici che coinvolgono molteplici sedi anatomiche. Nel nostro laboratorio è possibile effettuare un test genetico per la ricerca di mutazioni nel gene ALMS1, basato sul sequenziamento diretto del gene in soggetti che presentano un elevato sospetto clinico di ALMS. Dato il ruolo ancora dibattuto dell’analisi genetica in pazienti ALMS o in familiari, abbiamo cercato di valutare l’impatto e l’utilità di questo servizio, evidenziando come l’associazione di un’accurata anamnesi clinica e del test genetico reso disponibile consenta la formulazione di una diagnosi conclusiva in circa l’80% dei casi sospetti. In diversi reperti autoptici di tessuti di pazienti ALMS è stata descritta una estesa fibrosi interstiziale, che si ritiene poter essere responsabile delle progressive alterazioni funzionali che si osservano in modo particolare a livello cardiaco, epatico e renale, e che influenzano severamente la prognosi e la sopravvivenza dei pazienti. I meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo della fibrosi in ALMS non sono ancora stati analizzati in dettaglio, e non è chiaro se rappresentino un effetto diretto della mutazione, o una risposta secondaria a un danno cellulare dovuto alla perdita di funzione del gene ALMS1. Il lavoro descritto in questa tesi analizza il ruolo di mutazioni del gene ALMS1 nello sviluppo della fibrosi utilizzando colture primarie di fibroblasti di 4 pazienti ALMS, ottenute da una biopsia cutanea in una zona che non mostrava segni di fibrosi. La caratterizzazione morfologica di colture bidimensionali ha evidenziato nei fibroblasti ALMS una forma allungata e la presenza di estroflessioni citoplasmatiche, che non si osservano nei fibroblasti di controllo. I fibroblasti ALMS, coltivati su supporti tridimensionali di acido ialuronico, che mimano condizioni dinamiche di stress fisiologico, stimolando la deposizione di matrice extracellulare (ECM), mostrano una ridotta motilità e una incapacità di migrazione all’interno della matrice di supporto stessa. Questo potrebbe indicare possibili alterazioni delle strutture citoscheletriche, come anche suggerito dalla particolare disposizione delle fibre del citoscheletro, parallela alla polarità del nucleo, evidenziata nei fibroblasti ALMS mediante microscopia elettronica. L’analisi del profilo d’espressione genica, mediante la tecnica dei microarrays, ha permesso di evidenziare nei fibroblasti ALMS la modulazione di numerosi geni che codificano per proteine che svolgono funzioni a livello della proliferazione, regolazione del ciclo cellulare e di fenomeni apoptotici. Sono inoltre risultati modulati geni per proteine della ECM, strutture implicate nella replicazione cellulare, microtubuli e filamenti intermedi. In accordo con i dati di array, abbiamo confermato mediante qPCR l’aumento dell’espressione nei fibroblasti ALMS di componenti della ECM (POSTN e collageni), che correla con una maggiore produzione di proteine collagene, quantificata attraverso l’analisi dell’incorporazione di 3[H]-prolina. I fibroblasti ALMS presentano inoltre un ciclo cellulare più lungo in diverse condizioni di coltura, una aumentata responsività a fattori pro-fibrotici e una maggiore resistenza alla morte cellulare indotta dal trattamento con diversi stimoli apoptotici. I risultati presentati in questa tesi descrivono alcuni aspetti del fenotipo dei fibroblasti ALMS che possono essere utili nella comprensione della fisiopatologia della Sindrome, con particolare riguardo alla fibrosi. Possiamo ipotizzare che la presenza di mutazioni a livello del gene ALMS1 determini nei fibroblasti un rallentamento del ciclo cellulare e una maggiore resistenza a stimoli apoptotici. Conseguentemente, i fibroblasti ALMS non vanno incontro a fenomeni di apoptosi, ma persistono, continuano a proliferare, seppur lentamente, producendo un eccesso di componenti della ECM, responsabile del progressivo rimodellamento della normale architettura tissutale, portando allo sviluppo di fibrosi. Il microambiente circostante potrebbe inoltre essere caratterizzato dalla presenza di numerosi mediatori pro-fibrotici e infiammatori, in grado di stimolare ulteriormente l’attività fibrogenica. Nel loro insieme, i risultati ottenuti permettono da una parte di considerare la fibrosi presente nella ALMS un difetto primario direttamente legato alla presenza di mutazioni del gene ALMS1, dall’altra suggeriscono che ALMS1 sia una proteina multifunzionale e intervenga in fenomeni intra- ed extra-cellulari.