Functional Splicing Assay mediante l'utilizzo di minigeni plasmidici nel gene NF1

Le recenti conoscenze sulla complessità del processo di splicing, hanno rivelato l’esistenza di importanti elementi di regolazione dello stesso. Variazioni di questi nuovi elementi, che si trovano sia nelle regioni codificanti che non codificanti dei geni, possono manifestarsi con effetti deleteri sullo splicing del pre-mRNA. Forse una delle ipotesi più accreditate di questi anni è che anche variazioni silenti del modulo di lettura o variazioni delle sequenze introniche siano da considerare responsabili di patologie. L'attivazione di pseudo-esoni o di esoni criptici in seguito alla creazione di nuovi siti di splicing o all’alterazione di siti di splicing costitutivi sono eventi già osservati come causa di patologie da difetti dello splicing. Tuttavia, le informazioni attualmente disponibili sulle patologie genetiche rivelano che le conoscenze su molti dei meccanismi fondamentali che regolano lo splicing del pre-mRNA sono ancora molto scarse. I difetti di splicing costituiscono il 30-50% del totale di mutazioni del gene NF1. Circa il 30% di queste mappa lontano dalle giunzioni esone-introne dove possono causare la creazione di nuovi siti di splicing, attivare siti cripitici, o portare alla perdita o formazione di sequenze segnale esoniche e/o introniche, importanti per il riconoscimento del messaggero da parte dei fattori di splicing. Sulla base di queste premesse l’obbiettivo di questo lavoro è stato di ricercare mutazioni potenzialmente alteranti il meccanismo di splicing e di sviluppare un minigene plasmidico per caratterizzare in vitro l’effetto di queste variazioni genomiche sul meccanismo e sulle sue alterazioni. Inizialmente è stata effettuata un’analisi di screening di mutazioni nel gene NF1 su 310 pazienti affetti da Neurofibromatosi di tipo 1 afferiti presso il servizio di Genetica Clinica ed Epidemiologia del Dipartimento di Pediatria dell’Università degli Studi di Padova. La ricerca di mutazione è stata eseguita mediante DHPLC e HRMA. Ne sono emerse 196 mutazioni a carico del suddetto gene di cui 41 che alterano, o potrebbero alterare, il meccanismo di splicing. Nel caso delle mutazioni osservate de novo sono stati eseguiti dei test in silico mediante l'utilizzo di software disponibili in rete come: BDGP: Splice Site Prediction by Neural Network (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) e NetGene 2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2) che analizzano variazioni a carico delle sequenze consensus GT-AG dello splicing, Human Splicing Finder Version 2.4 (http://www.umd.be/HSF/) e ESEfinder Release 3.0 (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home) che, basandosi su modelli di calcolo predittivi, prendono in considerazione anche le alterazioni delle sequenze ESE (Exonic Splicing Enhancer), ESS (Exonic Splicing Silencer), ISE (Intronic Splicing Enhancer) e ISS (Intronic Splicing Silencer). Per la valutazione in vitro è stato costruito un b-globin minigene. Clonando all’interno di questo vettore la regione genomica interessata dalla mutazione, questo diventa un veicolo per trasfettare in modo transiente cellule HeLa in modo da poter estrarre i trascritti e valutare l’alterazione dello splicing. L’analisi dei prodotti di trascrizione ha confermato la funzionalità del sistema. Nel caso della variazione NF1 IVS 5-5 T>G si è potuto osservare che tale mutazione provoca lo skipping dell’esone 6 del gene NF1. In un caso particolare è stata utilizzata la metodica per valutare gli effetti della variazione: CFTR IVS 4+3 A>G. L’analisi ha evidenziato che dal costrutto mutato si ottengono tre prodotti di trascizione: un trascritto wild type, un trascritto che presenta la delezione di 93 nucleotidi all’estremità 3’ dell’esone 4 di CFTR e un trascritto che presenta il completo skipping dell’esone 4 di CFTR. In aggiunta sono stati effettuati anche degli studi epidemiologici valutando mediante HRMA la presenza di tale variante in 250 individui sani di controllo. Il calcolo delle frequenze alleliche e l’analisi dei trascritti ha portato ad affermare che la variazione 621+3 A>G non sia da considerarsi la causa di forme gravi di Fibrosi Cistica, andando a smentire quanto precedentemente riportato in letteratura. Il lavoro è stato di recente pubblicato sulla rivista internazionale Journal of Human Genetics.