The role of GABAergic interneurons and astrocytes in the mechanism of seizure generation and propagation

I segnali inibitori generati da una grande varietà di interneuroni GABAergici hanno un ruolo cruciale nell’assicurare il corretto funzionamento dei circuiti neuronali nel cervello. Gli interneuroni GABAergici sono anche direttamente coinvolti in numerose patologie neurologiche, compresa l’epilessia. L’azione inibitoria di questi interneuroni è in grado di contrastare le crisi epilettiche, e, infatti, gli agenti farmacologici che rafforzano la trasmissione sinaptica GABAergica sono utilizzati come farmaci anticonvulsivanti per i pazienti epilettici. Tra le numerose classi di interneuroni GABAergici, gli interneuroni esprimenti Parvalbumina (Pv) sembrano giocare un ruolo fondamentale nel controllo delle crisi epilettiche. In modelli sperimentali di epilessia ed in pazienti umani è stato dimostrato che queste cellule generano un’inibizione a feedforward, che si oppone efficacemente alla propagazione delle crisi epilettiche. Quando gli interneuroni Pv sono stati attivati artificialmente in vivo con tecniche optogenetiche, le crisi in corso sono state rapidamente interrotte. Ciò nonostante, altri studi hanno dimostrato che gli interneuroni Pv possono, in determinate circostanze, favorire la generazione delle crisi epilettiche. Non è quindi chiaro se l’intensa attività di questo sottogruppo di interneuroni abbia un effetto pro - o anti - epilettico. Nella mia tesi di dottorato ho usato un innovativo modello di epilessia focale in fettine cerebrali di topo, dove il sito di generazione delle scariche epilettiche (focus) può essere precisamente identificato, per studiare il ruolo degli interneuroni Pv nella generazione e nella propagazione delle scariche epilettiche attraverso tecniche di elettrofisiologia, optogenetica e imaging. Innanzitutto ho osservato che l’attivazione ritmica degli interneuroni Pv nella zona focale non è in grado di prevenire la generazione di una scarica epilettica, mentre ha invece contribuito a prolungare la durata della crisi attraverso la sincronizzazione degli afterdischarges, picchi di attività tipici della fase clonica. Inoltre, questo pattern di attivazione degli interneuroni Pv ha indotto nei neuroni piramidali un rebound spiking post – inibitorio che ha intensificato la sincronia della rete neuronale, facilitando così la generazione della crisi. Al contrario, l’attivazione degli interneuroni Pv nelle aree distanti dal focus ha bloccato con successo la propagazione della scarica epilettica e ha ridotto la durata della crisi nel focus. Ho poi dimostrato che la ridotta durata della crisi nell’area focale è una conseguenza diretta del blocco della propagazione che ha probabilmente impedito ai nuovi afterdischarges di viaggiare a ritroso verso il focus per mantenere l’attività epilettica. La dicotomia funzionale degli interneuroni Pv descritta in questa tesi apre nuove prospettive per comprendere come i circuiti inibitori locali governano la generazione e la propagazione dell’attività epilettica focale. Vista la grande mole di dati esistenti che indicano gli interneuroni Pv come protagonisti centrali nell’epilessia, è possibile ipotizzare che disfunzioni a loro carico contribuiscano alla patogenesi di forme genetiche come l’epilessia mioclonica severa dell’infanzia (SMEI, detta anche sindrome di Dravet). Questa grave patologia neurologica è una rara forma di encefalopatia epilettica caratterizzata da esordio precoce, crisi epilettiche associate ad elevata temperatura corporea ed elevato tasso di mortalità. La SMEI è associata ad una mutazione che causa l’inattivazione di uno dei due alleli codificanti la subunità alfa del canale del sodio voltaggio-dipendente NaV 1.1. Recentemente, è stato generato un modello murino di SMEI che riproduce abbastanza bene il fenotipo umano della malattia. In questo modello, gli interneuroni Pv sembrano essere selettivamente affetti dalla delezione dei canali NaV 1.1, provocando in queste cellule una riduzione di eccitabilità che può portare alla disinibizione della rete neuronale e, eventualmente, alle crisi epilettiche. Alla luce di queste premesse, nell’ambito di un’estesa caratterizzazione dell’attività sinaptica e di network in modelli in vitro ed in vivo da topi eterozigoti per la delezione dei canali NaV 1.1, ho osservato che le scariche epilettiche si propagano più velocemente nelle fettine cerebrali provenienti da topi eterozigoti per la delezione rispetto ai topi selvatici di controllo. Questa evidenza suggerisce un indebolimento dell’inibizione a feedforward derivante probabilmente dalla ridotta eccitabilità degli interneuroni Pv. Infine, dato che negli ultimi anni si sta facendo strada con forza una visione del funzionamento del cervello dove i neuroni collaborano strettamente con gli astrociti, ho voluto capire se esiste una interazione specifica tra interneuroni GABAergici ed astrociti, e quali conseguenze questa interazione ha sull’attività neuronale. Infatti, i neurotrasmettitori sono in grado di stimolare risposte Ca2+ negli astrociti le quali, a loro volta, possono provocare il rilascio di molecole neuroattive, comunemente note come gliotrasmettitori. Tuttavia, mentre la comunicazione tra astrociti e neuroni eccitatori è ben caratterizzata, l’interazione con gli interneuroni inibitori è ancora largamente inesplorata. In particolare, questa interazione può essere molto rilevante nell’epilessia, dove osserviamo una massiccia attività GABAergica durante la generazione e la propagazione della scarica epilettica. A questo proposito, ho osservato che nelle fettine di corteccia somatosensoriale e temporale caricate con l’indicatore Ca2+ Fluo-4 AM, la maggior parte degli astrociti nello strato 5 ha mostrato aumenti di Ca2+ in risposta all’applicazione di GABA o di Baclofen (un agonista specifico del recettore metabotropico GABAB). Per verificare se gli astrociti attivati dal GABA possano rilasciare glutammato, ho effettuato registrazioni di patch-clamp da neuroni piramidali grazie alle quali ho potuto verificare che l’attivazione del recettore GABAB negli astrociti provocava correnti depolarizzanti lente (SIC) nei neuroni mediate da recettore NMDA. I risultati di questi esperimenti suggeriscono che gli astrociti possono convertire nei circuiti locali un forte input inibitorio in un output eccitatorio ritardato, e che evidentemente esiste una comunicazione bidirezionale tra astrociti e interneuroni GABAergici che apre nuove prospettive sul ruolo di queste cellule nella fisiopatologia cerebrale.