Alfa-sinucleina e membrane: esame dei parametri che influiscono sull' interazione e messa a punto di un sistema membrano mimetico adatto a studi NMR

L'alfa-sinucleina è una piccola proteina espressa principalmente ai terminali presinaptici, che è divenuta l'oggetto di numerosi studi da quando sono state identificate alcune sue mutazioni tossiche che portano alla sua aggregazione in diverse patologie neurodegenerative, tra cui la malattia di Parkinson, la malattia di Alzheimer e la demenza con corpi di Lewy. In condizioni fisiologiche l'alfa-sinucleina ha una struttura disordinata, ma nei corpi di Lewy, di cui è il principale costituente, è stata trovata in struttura ß. Inoltre, la sua porzione N-terminale assume una conformazione elicoidale in presenza di micelle di SDS o di SUV (small unilamellar vesicles) e, proprio sulla base di queste osservazioni, è stata fatta un'ipotesi sul ruolo fisiologico della proteina (ancora sconosciuto) che la vedrebbe coinvolta nel processo di riciclo delle vescicole sinaptiche. Alcuni dettagli di questa struttura sono tuttavia ancora controversi: in micelle di SDS, tutti gli studi NMR condotti fino a questo momento concordano nell'affermare che la proteina si trova sulla superficie della micella e la maggior parte di essi afferma che sia presente almeno un loop flessibile nella struttura, tra la leucina 38 e la treonina 44. Questa regione della proteina è molto particolare: contiene, infatti, la tirosina 39, un residuo che in condizioni di stress ossidativo, può essere ossidato, ed è già stato chiarito che la forma ossidata della proteina aggrega più facilmente. Una delle ipotesi strutturali riguarda la possibilità che alfa-sinucleina abbia una simile interazione con le vescicole sinaptiche presenti all'interno dei neuroni, ma l'interruzione dell'elica proposta dagli studi NMR potrebbe essere un artefatto dovuto alle piccole dimensioni delle micelle di SDS, che non sarebbero adatte ad ospitare un'elica di 100 residui. Al contrario, questo loop flessibile potrebbe avere un ruolo funzionale e, proprio per indagare i dettagli strutturali dell'alfa-sinucleina in ambiente membrano-mimetico, ci siamo posti l'obiettivo di trovare un sistema diverso dalle classiche micelle (per evitare le critiche riguardanti la loro piccolo dimensione) ma sufficientemente piccolo da permetterci di ottenere segnali NMR. Per prima cosa abbiamo stabilito quali fossero le variabili che influivano sull'interazione proteina - membrana prendendo in esame tre frammenti della proteina in presenza di SUV: 1-99 (Syn99) che rappresenta tutta la porzione che può interagire con le membrane e contiene le sette ripetizioni imperfette che caratterizzano le porzione N-terminale dell'alfa-sinucleina; 1-52 (Syn52), costituito da quattro di tali ripetizioni; e 57-102 (Syn57-102) che contiene il frammento NAC (Non-Amyloid-Component) responsabile del processo di aggregazione della proteina. In questo caso le SUV sono un ottimo sistema membrano-mimetico, perché assomigliano alle vescicole sinaptiche presenti nel citoplasma neuronale con cui la proteina può interagire e svolgere la sua funzione fisiologica, ed è su questo tipo di sistema che abbiamo condotto alcune titolazioni al dicroismo per verificare il ruolo di alcuni parametri sulla capacità di strutturarsi dell'alfa-sinucleina, in particolare composizione, pH, temperatura e dimensione delle vescicole. Soprattutto i dati riguardanti l'effetto della dimensione sono stati particolarmente importanti e utili per i nostri scopi, perché aumentare il diametro delle SUV equivale a diminuire la curvatura sulla loro superficie e il sistema che volevamo usare per gli studi NMR è costituito dalle bicelle che non hanno alcuna curvatura. Fin dalla loro scoperta sono diventate un sistema membrano-mimetico molto usato per studi strutturali in soluzione, ma la maggior parte delle bicelle usate in letteratura sono composte da DMPC e DHPC, due fosfolipidi zwitterionici con cui la nostra proteina non è in grado di interagire, perciò abbiamo dovuto cambiare la composizione delle bicelle utilizzate. Per quanto ne sappiamo, tutti i tentativi fatti fino ad ora per preparare bicelle composte solo da fosfolipidi acidi non sono mai andati a buon fine, difficoltà che abbiamo riscontrato anche noi durante i tentativi di preparare bicelle costituite da POPS e DHPC. Per questo motivo la scelta dei fosfolipidi acidi è caduta su DMPG come fosfolipide a catena lunga, che ha la stessa porzione idrofobica di DMPC largamente usato in letteratura, am una testa polare carica negativamente a pH fisiologico che può permettere l'interazione con l'alfa-sinucleina. I campioni caratterizzati tramite TEM e DLS hanno mostrato un'eterogeneità  nelle dimensioni degli oggetti, ma, almeno per quanto riguarda i più piccoli, hanno la dimensione e la forma tipiche delle classiche bicelle. Abbiamo ottimizzato il protocollo di preparazione delle bicelle e raccolto diversi esperimenti DOSY a 37 °C per valutare la stabilità  delle bicelle aventi q = 1, che però si sono rivelate molto instabili. Il raggio idrodinamico misurato immediatamente dopo la preparazione era di circa 5 nm, ma aumentava a 40 - 50 nm dopo circa 10 ore. Dimensioni così grandi sono inutilizzabili dal punto di vista NMR, perciò abbiamo dapprima ridotto q a 0.5, ottenendo oggetti aventi un raggio di 6 - 10 nm, adatti al legame con una proteina di 100 residui come Syn99. Abbiamo verificato anche quale fosse la stabilità  delle bicelle in presenza di diversi sistemi tampone e diverse forze ioniche con lo stesso tipo di esperimenti, ma la presenza di sali aumentava la viscosità  dei campioni, tanto da renderli difficilmente maneggiabili, perciò abbiamo deciso di lavorare in acqua. Abbiamo testato anche diverse condizioni tramite CD per massimizzare l'interazione Syn99 - bicelle e, anche nel caso delle bicelle, la proteina mostra il classico spettro di un'alfa-elica: è questo il primo dato che vede l'alfa-sinucleina interagire con doppi strati planari. Abbiamo poi visto che tale interazione è favorita da una bassa forza ionica e non è influenzata dalla temperatura e abbiamo determinato, sempre tramite CD, il minimo rapporto fosfolipidi/Syn99 per cui si aveva la massima strutturazione. Nonostante l'ottimizzazione dell'interazione proteina - membrana, non siamo riusciti a raccogliere nessuno spettro NMR significativo, forse a causa dell'elevata dimensione e dell'instabilità  del sistema. Abbiamo, perciò, abbandonato l'idea di studiare il frammento Syn99, e abbiamo proseguito con lo studio dei due frammenti che lo costituiscono (Syn52 e Syn57-102) che insieme formano tutta la porzione N-terminale in grado di interagire con le membrane. Abbiamo preparato bicelle con q = 0.4, che sono molto più piccole e stabili delle precedenti nelle medesime condizioni, secondo i nostri dati DOSY. Abbiamo iniziato studiando Syn52 nelle stesse condizioni di Syn99, che si sono dimostrate le migliori anche per questo frammento. Abbiamo raccolto uno spettro HSQC (il primo su un peptide piùgrande di 30 amminoacidi legato a bicelle) che è stato confrontato con il risultato dello stesso esperimento in presenza di micelle di SDS e si sono notate alcune differenze. Abbiamo anche eseguito e assegnato spettri TOCSY-HSQC e NOESY-HSQC sul campione in SDS e vorremmo ripeterli sul campione in bicelle per esaminare le differenze nei chemical shift e trovare eventuali differenze strutturali, con particolare attenzione per il loop L38 - T44. Abbiamo cercato di ripetere la stessa procedura per Syn57-102, ma non siamo riusciti ad osservare la strutturazione del peptide, anche cambiando pH, temperatura e rapporto DMPG/peptide, in accordo con i dati trovati per il peptide in presenza di SUV grandi. Abbiamo anche cercato di raccogliere uno spettro HSQC senza tuttavia osservare alcun segnale.