CHANGES IN MITOCHONDRIAL CRISTAE STRUCTURE DETERMINE CELL VIABILITY IN MODELS OF HUNTINGTON'S DISEASE

I mitocondri sono organelli esseziali nella vita della cellula: essi rappresentano la maggiore fonte di ATP (Danial et al., 2003) e regolano importanti vie di trasduzione del segnale, dall'omeostasi del Ca2+ (Rizzuto et al., 2000) all'apoptosi. In seguito ad uno stimolo apoptotico i mitocondri rilasciano citocromo c e altre proteine solubili nello spazio intermembrana che sono necessarie, nel citoplasma, per l'attivazione e l'amplificazione della cascata del segnale che porta al disassemblamento della cellula. La maggior parte del citocromo c e dei componenti della fosforilazione ossidativa sono localizzati all'interno delle cristae. Grazie ai notevoli sviluppi della microscopia elettronica associata a ricostruzione tridimensionale il modello di ultrastruttura dei mitocondri è stato recentemente rivoluzionato; le cristae, dapprima identificate come semplici invaginazioni della membrana mitocondriale interna (IMM) (Palade, 1952), risultano essere compartimenti distinti di IMM, separati dallo spazio intermembrana da giunzioni tubulari strette definite cristae junctions (Mannella et al., 1994). Durante l'apoptosi, per garantire un completo rilascio di citocromo c le singole cristae si fondono tra loro e le giunzioni tubulari strette si allargano: questo processo, noto con il nome di cristae remodelling, è associato alla mobilizzazione del citocromo c dal compartimento intracristale allo spazio intermembrana, evento necessario per il suo successivo rilascio attraverso la membrana mitocondriale esterna (Scorrano et al., 2002). Il rimodellamento ultrastrutturale è accompagnato da una massiva frammentazione del reticolo mitocondriale. La forma del reticolo mitocondriale è determinata dall'equilibrio tra eventi di fusione e fissione, controllati da numerose proteine tra cui le GTPasi simili a dinamine. In cellule di mammifero, la fusione mitocondriale è controllata dalle proteine mitofusina-1 (MFN1) e mitofusina-2 (MFN2) nella membrana esterna e da OPA1 nella membrana mitocondriale interna (Olichon et al., 2002). Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che OPA1 promuove la fusione dei mitocondri solo in presenza di mitofusina 1 (Cipolat et al., 2004). La fissione richiede il passaggio aggiuntivo della traslocazione della proteina Drp1 dal citosol ai mitocondri, dove si ancora a hFis1, il suo adattatore molecolare nella OMM. L'oligomerizzazione di Drp1 fornisce la forza meccanica per costringere le membrane mitocondriali fino alla frammentazione dellâ organello (Hinshaw et al., 1999; Smirnova et al., 2001). La traslocazione di Drp1 ai mitocondri dipende dalla sua defosforilazione ad opera della fosfatasi calcineurina e di altre fosfatasi (Cereghetti et al., 2008). Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che le proteine che regolano la morfologia dei mitocondri giochino un ruolo nella morte cellulare. Nel nostro laboratorio è stato recentemente dimostrato che OPA1 protegge dall'apoptosi prevenendo il rilascio di citocromo c in maniera indipendente dal suo ruolo profusogeno. OPA1 agisce controllando il processo di rimodellamento delle cristae e mantiene strette le giunzioni delle cristae attraverso la formazione di oligomeri, costituiti da una forma solubile localizzata nello spazio intermembrana e una forma integrale della IMM (Frezza et al., 2006; Cipolat et al., 2006). Inoltre, numerosi lavori hanno dimostrato che l'espressione di un mutante dominante negativo di Drp1 è in grado di prevenire la frammentazione mitocondriale, il rilascio di citocromo c e la morte cellulare indotti da stimoli apoptotici intrinseci (Frank et al., 2001). E'interessante notare che Drp1 sembra regolare in modo specifico il rilascio di citocromo c suggerendo una sua capacità  di regolare la sub compartimentalizzazione mitocondriale di questo fattore pro-apoptotico (Parone et al., 2006). Lo scopo della mia tesi è stato quello di studiare il ruolo della frammentazione mitocondriale regolata da calcineurina nella morte cellulare e nella patogenesi della Corea di Huntington. Recentemente, nel nostro laboratorio è stato dimostrato che la depolarizzazione mitocondriale causa l'attivazione della fosfatasi citosolica calcineurina. Calcineurina defosforila Drp1 in corrispondenza del residuo di serina 637, stimolandone la traslocazione ai mitocondri e causando la frammentazione degli organelli (Cereghetti et al., 2008). Allo scopo di caratterizzare l'importanza di questa via del segnale nell'apoptosi abbiamo focalizzato la nostra attenzione su un nuovo specifico inibitore di calcineurina: il peptide PPD1, che corrisponde al dominio peptidilprolil isomerasico della immunofillina FKBP52. PPD1 è codificato geneticamente e quindi risulta essere più stabile degli inibitori farmacologici. Attraverso esperimenti di immunoprecipitazione, abbiamo dimostrato che PPD1 non influenza l'interazione di Drp1 con il complesso motore contenente la dineina, anch'esso coinvolto nella traslocazione di Drp1 ai mitocondri. Un'analisi cinetica tramite microscopia confocale di cellule esprimenti una variante spettrale della green fluorescent protein, la red fluorescent protein (mtRFP), specificatamente diretta alla matrice mitocondriale, ci ha permesso di verificare che l'espressione di PPD1 inibisce fortemente la frammentazione del reticolo indotta da depolarizzazione mitocondriale. Questo effetto può essere attribuito alla riduzione di traslocazione di Drp1 ai mitocondri. Abbiamo poi voluto controllare se l'inibizione della frammentazione esercitata da PPD1 potesse interferire con l'apoptosi. A questo scopo abbiamo analizzato la cinetica della morte cellulare indotta da stimoli apoptotici intrinseci. L'analisi ha rivelato che l'espressione di PPD1 è in grado di proteggere dalla morte cellulare indotta da staurosporina, perossido di idrogeno, etoposide e tapsigargina. Inoltre, un saggio clonogenico ha confermato l'effetto protettivo di PPD1, poichè cellule esprimenti il peptide hanno dimostrato un'aumentata capacità  di formare colonie dopo il trattamento con staurosporina. Per capire se PPD1 potesse influenzare il rilascio di citocromo c abbiamo espresso la proteina mtRFP come marker mitocondriale e abbiamo immunodecorato il citocromo c con un anticorpo coniugato ad un fluoroforo verde (FITC). L'overespressione di PPD1 è in grado di prevenire il rilascio di citocromo c in risposta alla staurosporina. Abbiamo poi voluto accertare se l'inibizione dell'apoptosi da parte di PPD1 dipendesse in modo specifico dalla sua azione sulla proteina Drp1. A questo scopo èstato necessario escludere che l'effetto di PPD1 fosse dovuto all'inibizione della fosforilazione di altri substrati di calcineurina coinvolti nell'apoptosi, come il membro della famiglia di proteine Bcl2 BAD. Ci siamo quindi avvalsi di un approccio genetico andando ad analizzare l'effetto di PPD1 sulla morte cellulare in fibroblasti murini embrionali wt e ko per BAD. I nostri esperimenti hanno dimostrato che BAD non è necessaria per l'effetto anitapoptotico di PPD1, poichè il peptide protegge dalla morte cellulare anche cellule BAD ko. Inoltre, la co-espressione di PPD1 e un mutante dominante negativo di DRP1 (DRP1K38A) non risulta in un effetto di protezione aggiuntivo, indicando che le due proteine agiscono nella stessa via di trasduzione del segnale. Questi dati rappresentano un'ulteriore conferma del ruolo decisivo giocato dalla frammentazione mitocondriale e dai modulatori della morfologia mitocondriale nell'apoptosi (Cereghetti, Costa et al., in revisione, Cell Death and Differentiation). Un crescente numero di studi dimostra che in condizioni patologiche caratterizzate da aumentata apoptosi, come nelle patologie neurodegenerative, i mitocondri presentano alterazioni della morfologia del reticolo e della loro ultrastruttura. In particolare, analisi di microscopia elettronica di linfoblasti da pazienti affetti da Corea di Huntington hanno evidenziato mitocondri con profonde alterazioni ultrastrutturali comparabili a quelle osservate durante il processo di rimodellamento dell cristae. La Corea di Huntington è una patologia neurodegenerativa genetica causata dalla anomala espansione di un dominio poliglutamminico nella proteina Huntingtin. La principale caratteristica clinica della patologia è la perdita selettiva di neuroni GABA-ergici dello striatum che causa l'insorgenza di disturbi motori e cognitivi. Abbiamo deciso di caratterizzare le alterazioni morfologiche dei mitocondri e il loro effetto sulla morte cellulare in due diversi modelli della malattia: linfoblasti immortalizzati isolati da pazienti e precursori di neuroni striatali derivati da un modello murino transgenico avente una espansione delle ripetizioni CAG nel gene endogeno per la proteina huntingtin. L'analisi tramite microscopia confocale di cellule trasfettate con una proteina fluorescente gialla diretta ai mitocondri (mtYFP) ha rivelato che le cellule aventi la mutazione presentavano un reticolo mitocondriale frammentato se paragonate alle relative cellule di controllo.E' importante notare che la frammentazione è risultata essere più evidente in linfoblasti da pazienti omozigoti che da eterozigoti indicando una correlazione tra la severità  del fenotipo e il genotipo. Abbiamo poi controllato se il fenotipo morfologico potesse essere causato da alterazioni nei livelli delle proteine che controllano la forma dei mitocondri. I nostri esperimenti non hanno rivelato differenze nei livelli di espressione, ma abbiamo osservato che la proteina Drp1 era maggiormente associata ai mitocondri isolati da cellule di Huntington che dalle wt. Inoltre, esperimenti di crosslinking hanno evidenziato una aumentata oligomerizzazione di Drp1 nelle cellule aventi la mutazione. Questi dati hanno suggerito che l'eccessiva attivazione dell'apparato di fissione potesse essere la causa della frammentazione osservata. Abbiamo inoltre riscontrato alterazioni nella abbondanza relativa delle isoforme di OPA1 allo stato stazionario e del loro processamento in risposta a trattamento con staurosporina. Questo dato spinge ad ipotizzare un potenziale meccanismo molecolare attraverso il quale Drp1 possa regolare la struttura delle cristae. Abbiamo poi cercato di correggere il fenotipo morfologico promuovendo la fusione o inibendo la fissione dei mitocondri. L'overespressione di proteine profusogene OPA1 e MFN1 e di mutanti dominanti negativi di Drp1 e di calcineurina è risultata nella correzione del difetto morfologico. Il passo successivo è stato quello di indagare il significato funzionale delle alterazioni osservate, in particolare nella morte cellulare. Analisi tramite citofluorimetria condotta sui linfoblasti ha evidenziato una aumentata sensibilità alla morte indotta da staurosporina in cellule da paziente. Il risultato è stato confermato nel modello neuronale murino in cui è stato analizzato il processamento della proteina PARP (poly ADP-ribose polymerase), un evento caratteristico dell'apoptosi. L'overespressione di OPA1 e di DRP1K38A o il trattamento con l'inibitore farmacologico di calcineurina FK506 ha riportato la sensibilità  all'apoptosi in cellule di Huntington a livelli paragonabili a quelli delle cellule di controllo. Al contrario, l'overespressione di MFN1 non ha conferito protezione contro la morte cellulare, suggerendo che la fusione mitocondriale per se non è sufficiente a contrastare gli stimoli apoptotici. L'analisi della cinetica del rilascio di citocromo c da mitocondri isolati in risposta al trattamento con lo stimolo apoptotico cBID, attraverso l'uso di uno specifico saggio ELISA, ha evidenziato che mitocondri da cellule di Huntington rilasciano il citocromo c più velocemente che i relativi controlli. Inoltre, esperimenti di crosslinking hanno dimostrato che l'aumentato rilascio di citocromo c correla con una più rapida distruzione degli oligomeri di OPA1. L'aumentato rimodellamento delle cristae nei mitocondri da cellule aventi l'espansione poliglutamminica è stato confermato attraverso analisi di microscopia elettronica in seguito a trattamento con staurosporina. In cellule mutate il numero medio di cristae per mitocondrio allo stato stazionario è risultato ridotto e le cristae risultano profondamente alterate e riorganizzate dopo trattamento con lo stimolo apoptotico. L'overespressione di OPA1 e di DRP1K38A ha aumentato il numero di cristae correttamente strutturate e ha inibito il loro rimodellamento durante l'apoptosi. In conclusione, i dati presentati in questa tesi di dottorato mostrano che la regolazione della frammentazione mitocondriale da parte dell'asse calcineurina-DRP1 gioca un ruolo cruciale nella progressione della cascata apoptotica. Abbiamo potuto dimostrare che questa via è alterata nella Corea di Huntington e partecipa all'aumentata apoptosi che caratterizza questa patologia neurodegenerativa. Inoltre, questo modello ci ha permesso di chiarire la relazione tra la regolazione della forma del reticolo mitocondriale e la struttura delle cristae, identificando in OPA1 un possibile nesso molecolare (Costa et al., sottomesso, EMBO Mol. Med.).