Production and characterization of SulP anion transporters

L’oggetto principale di questo lavoro di tesi è la famiglia dei trasportatori anionici SulP (Sulphate Permease), che comprende più di duecento membri identificati in archea, batteri, funghi, piante e animali. Molte proteine di questa famiglia sono state funzionalmente caratterizzate e agiscono da trasportatori o scambiatori di anioni, e differiscono per l’affinità verso il substrato e il meccanismo di trasporto (Saier et al., 1999). Nei mammiferi la famiglia SulP, conosciuta come "Solute Linked Carrier 26" (SLC26), è composta di undici membri che svolgono un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici nell’uomo (Mount e Romero, 2004). Tutte le proteine SulP possiedono un’organizzazione strutturale simile: una parte centrale idrofobica, che comprende dieci o dodici eliche di membrana e una porzione C-terminale citoplasmatica meno conservata, che include il dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Sebbene non sia ancora chiaro il ruolo funzionale di questo dominio nei trasportatori di anioni, esso sembra essere di cruciale importanza per la regolazione dell’attività di trasporto (Ko et al., 2004; Zheng et al., 2005; Shibagaki e Grossman, 2006). Il suo ruolo fondamentale è rilevato anche dal fatto che mutazioni che alterano questo dominio nei membri della famiglia SLC26 possono comprometterne seriamente la funzionalità, causando malattie genetiche gravi, come la displasia diastrofica o la sindrome di Pendred (Dawson and Markovich, 2005). Non sono ancora note strutture tridimensionali di nessun dominio o intera proteina SulP. Una parte del lavoro è stata focalizzata sulla produzione di diverse varianti del dominio STAS da specie diverse, finalizzata alla caratterizzazione biofisica e strutturale. Una seconda parte del progetto, svolta presso la "Johann Wolfgang Goethe University" di Francoforte (Germania), ha riguardato la produzione di intere proteine SulP mediante la sintesi in vitro, una tecnica molto promettente per la produzione su larga scala di proteine di membrana. Durante l’ultimo anno, mi sono anche dedicata allo studio cristallografico di un mutante della Green Fluorescent Protein, GFPmut2, in collaborazione con il gruppo del Prof. Stefano Bettati dell’Università di Parma. L’obiettivo principale di questo lavoro è stato definire le basi strutturali delle proprietà spettroscopiche di questo mutante, in particolare al variare del pH. Il cromoforo della GFP può, infatti, esistere sia in forma protonata che deprotonata (Tsien, 1998). Le proprietà spettroscopiche della GFPmut2 (Ser65Ala, Val68Leu, Ser72Ala) sono state in precedenza caratterizzate e, rispetto alla proteina wild type, sembra essere più sensibile alle variazioni di pH nell’intervallo fisiologico (Chirico et al., 2002). A tal fine, è stata determinata la struttura della GFPmut2, sia a pH 6 che a pH 9, con una risoluzione di circa 1.6 Å. Il confronto delle due strutture ha consentito la correlazione delle proprietà strutturali con quelle spettroscopiche.