Plant Food Allergens Purification and Characterisation of the Ses i 2 Major Allergen from Sesamum indicum Structure-Stability-Allergenicity Relationships of Native and Methionine-Oxidised Species

Il termine allergia viene utilizzato per indicare una reazione immunitaria esagerata dell’organismo contro una sostanza innocua presente nell’ambiente, (quali sono gli allergeni da contatto, da ingestione e da inalazione), la quale causa sintomi patologici in soggetti predisposti. La fisiopatologia della risposta allergica coinvolge una fase detta di sensibilizzazione che si sviluppa immediatamente dopo la prima esposizione all’allergene ed una fase tardiva nella quale vengono sostanzialmente prolungati i sintomi della risposta allergica con conseguente danno tissutale. I dati epidemiologici indicano che più del 20% della popolazione mondiale soffre di malattie allergiche IgE-mediate causate da allergeni di diversa origine. In particolare, l’allergia alimentare affligge il 2% della popolazione mondiale adulta e circa l’8% della popolazione mondiale al di sotto dei tre anni di vita. Gli allergeni da piante sono classificati in famiglie e superfamiglie proteiche sulla base delle loro caratteristiche strutturali e conformazionali. Il gruppo più diffuso di proteine vegetali è classificato nelle seed storage proteins in cui si possono ritrovare gli allergeni della superfamiglia delle cupine e delle prolamine. La superfamiglia delle cupine include le proteine allergeniche di accumulo nei semi della classe delle viciline e legumine presenti nella soia, nelle arachidi e noci. La superfamiglia delle prolamine include molti importanti allergeni nei legumi, nelle noci, cereali, frutta e verdura, i quali sono suddivisi nelle classi delle: 2S albumine, nonspecific lipid transfer protein, α-amilasi dei cereali e inibitori delle proteasi. La ricerca clinica ha dimostrato interesse crescente per la classe delle 2S albumine le quali sono state descritte come allergeni maggiori in un numero elevato di piante alimentari. Chiaramente gli allergeni alimentari, per indurre risposta allergica, devono evitare i processi proteolitici intraluminali ed intracellulari e raggiungere le cellule immunocompetenti nella lamina propria, ma i meccanismi mediante i quali gli allergeni aggirano il fenomeno di tolleranza e inducono la produzione di IgE specifiche sono ancora sconosciuti. Inoltre, mancano informazioni chiave sulle caratteristiche strutturali degli allergeni alimentari che risultano essere determinanti nello sviluppo di una risposta immunitaria piuttosto che dei meccanismi di tolleranza. Esiste una sostanziale differenza nella capacità di indurre una risposta immunitaria specifica tra un antigene ed un immunogeno. L’antigenicità è l’abilità di una sostanza di combinarsi in modo specifico con i prodotti finali del sistema immunitario (anticorpi e/o recettori di membrana). Sebbene tutte le molecole immunogene possiedano proprietà antigeniche non è possibile affermare il contrario, infatti, l’immunogenicità è definita come l’abilità di una sostanza detta immunogeno di indurre una risposta specifica umorale e/o cellulo-mediata. L’immunogenicità non è una proprietà intrinseca di un antigene, ma dipende dal sistema biologico con cui l’antigene stesso entra in contatto. In questo lavoro abbiamo studiato l’allergene maggiore da semi di sesamo Ses i 2 (Q9XHP1) che rappresenta un modello adeguato per investigare le caratteristiche strutturali e conformazionali associate agli allergeni alimentari In questo lavoro, abbiamo purificato in quantità sufficiente (10-30 mg) l’allergene maggiore da semi di sesamo (S. indicum) Ses i 2 per successivi studi strutturali e conformazionali. Durante i nostri studi sono stati ottenuti una grande quantità di dati chimici e strutturali che sono confluiti in un modello strutturale per omologia di Ses i 2. Il modello mostra la tipica struttura delle 2S albumine con quattro segmenti alpha-elicoidali a formare un core idrofobico compatto organizzato in una architettura up-and-down. La struttura globulare di Ses i 2 è stabilizzata da cinque ponti disolfuro, in particolare otto residui di Cys sono conservati nella famiglia delle prolamine. Ses i 2 mostra, inoltre una straordinaria stabilità verso la denaturazione chimica e termica, associata a una forte resistenza alla proteolisi dei principali enzimi gastrointestinali, lisosomiali, di matrice e della coagulazione. Queste osservazioni permettono di ipotizzare un assorbimento della proteina in forma intatta a livello intestinale. Alla luce di queste considerazioni la derivatizzazione chimica di Ses i 2 con un label fluorescente come la fluoresceina isotiocianato è stata eseguita con l’intento di esplorare l’internalizzazione cellulare dell’allergene mediante analisi di immunofluorescenza. Per evidenziare l’internalizzazione cellulare, il coniugato Ses i 2-[F] è stato incubato con cellule Caco-2, che in specifiche condizioni formano un mostrato simile all’epitelio intestinale. I dati raccolti dimostrano che Ses i 2 viene assorbito attraverso un processo endocitotico e questa informazione associata alla resistenza agli enzimi lisosomiali permette di ipotizzare una interazione di Ses i 2 in forma intatta con le cellule dendritiche nella lamina propria. L’immunogenicità è fortemente dipendente dagli effettori che l’antigene incontra, in particolare nei siti di infiammazione i processi ossidativi giocano un ruolo fondamentale nella degradazione dell’antigene. Nei siti dell’infiammazione, H2O2 e HOCl sono i principali ossidanti prodotti e possiedono l’abilità di reagire con una vasta gamma di macromolecole e nelle proteine il residuo amminoacidico più sensibile all’ossidazione è la metionina. Sorprendentemente, la sequenza amminoacidica di Ses i 2 è particolarmente abbondante in Met (circa 16%), quindi in questo lavoro abbiamo investigato le conseguenze strutturali del danno ossidativo che si sviluppa in molte condizioni patologiche nelle quali è coinvolta l’infiammazione. I residui di metionina sono stati selettivamente ossidati in presenza di H2O2 ed del sistema mieloperossidasico. In questo lavoro, abbiamo dimostrato che Ses i 2 è fortemente stabilizzata da un core idrofobico di 9 Met, questa osservazione è risultata essere in stretto accordo con la drammatica alterazione strutturale e conformazionale indotta dall’ossidazione selettiva dei residui di Met in Ses i 2. Il forte effetto dell’ossidazione sulla stabilità di Ses i 2 ha suggerito un coinvolgimento del meccanismo ossidativo nella modulazione della risposta immunitaria. Nel sito della risposta immunitaria, l’ossidazione delle proteine allergeniche può rappresentare un passaggio critico nella difesa tissutale, nella risposta immunospecifica e nella risposta allergica. Alterazioni in questo meccanismo a livello dei processi ossidativi seguiti dai processi proteolitici operati dalle cellule immunocompetenti potrebbero giocare un ruolo chiave nell’indurre la risposta allergica. Per confermare questa ipotesi abbiamo studiato l’effetto di Ses i 2 e Ses i 2-ox su cellule dendritiche umane. Sorprendentemente, Ses i 2 induce una forte produzione di IL-10 con una diminuzione nell’espressione di IL-12p70, la più importante citochina nello sviluppo della risposta Th1. Contrariamente, Ses i 2-ox non è in grado di aumentare l’espressione di IL-10 e questo è correlato con la forte produzione di IL-12p70 da parte delle DCs. Ses i 2 e Ses i 2-ox hanno dimostrato un scarsa capacità di stimolare l’espressione delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86, mentre HLA è aumentato in presenza di Ses i 2-ox. Nell’insieme questi dati suggeriscono che Ses i 2 non è in grado di indurre una risposta Th1, mentre Ses i 2-ox, stimolando la produzione di IL-12p70 e l’espressione di HLA è capace di indurre una risposta Th1-self. Questi risultati sostengono l’ipotesi che il danno ossidativo e la processazione proteolitica di una antigene siano fortemente correlati nel determinarne l’immunogenicità. Da ultimo, abbiamo utilizzato la cristallografia a raggi-X con l’intento di risolvere la struttura di Ses i 2. Durante i nostri studi sono stati ottenuti cristalli che sottoposti a misurazione hanno fornito dei set di dati di diffrazione, ma al momento non hanno permesso una analisi strutturale completa della proteina.