REALIZZAZIONE DI SCAFFOLDS TRIDIMENSIONALI IN VITRO PER LA RIGENERAZIONE OSSEA

La rigenerazione ossea è proposta in ingegneria tessutale per il trattamento di diversi problemi ortopedici dovuti a molteplici cause. A partire dall’ultima decade, l’ingegneria tessutale provvede a fornire una valida alternativa per ovviare alle limitazioni terapeutiche e metodologiche che presentano il trapianto d’organo (autologo o eterelogo) e la ricostruzione chirurgica. Grazie al rapido miglioramento delle conoscenze dei biomateriali, si è potuto creare degli scaffold polimerici, biocompatibili e biodegradabili i quali possono garantire un sostegno temporaneo all’osso danneggiato e favorire la rigenerazione di nuovo tessuto. La componente chiave dell’ingegneria tessutale ossea è lo scaffold, che serve da stampo per l’interazione con le cellule e la formazione della matrice extracellulare dell’osso, inoltre provvede a fornire un supporto per il nuovo tessuto in via di formazione. Lo scaffold per la rigenerazione ossea deve rispondere a ben determinati criteri, come proprietà meccaniche simili al tessuto da riparare, biocompatibiltà e biodegradabilità, e deve possedere un certo grado di rimodellamento. Per un biomateriale da utilizzare nella rigenerazione ossea inoltre è importante la porosità, la quale garantisce la migrazione e la proliferazione delle cellule e la vascolarizzazione del tessuto in via di formazione. Inoltre la porosità migliora l’interconnessione tra l’impianto e l’osso naturale, e provvede a garantire una grande stabilità meccanica in questa interfaccia critica. Il policaprolattone (PCL) è un α-poliestere lineare , semicristallino approvato dalle Food and Drug Administration (FDA) per dispositivi da essere impiantati nel corpo umano. Esso viene degradato attraverso scissione idrolitica del legame estereo a pH fisiologico. Grazie alle sue proprietà di biocompatibilità, tasso di degradazione e di resistenza meccanica, è stato studiato come biomateriale per drug delivery e applicazione in ingegneria tessutale dell’osso. Lo scopo di questo lavoro è quello di ottenere uno scaffold di PCL realizzato attraverso la tecnica dell’inversione di fase usando un porogeno di dimensioni definite, in modo da ottenere una matrice con porosità, proprietà meccaniche e microstruttura tali da permettere l’adesione osteoblastica, la crescita e la differenziazione. In questo lavoro sono state realizzate diversi scaffolds di PCL con vari porogeni (PEG, saccarsosio, fruttosio, sfere e fili di alginato di calcio), inoltre per migliorare le proprietà meccaniche e la biocompatibilità, ma non influendo sulla porosità, alle matrici polimeriche sono state aggiunte idrossiapatite e una polvere d’osso naturale. Gli scaffold sono stati caratterizzati attraverso microscopia ottica a scansione e con microtomografia computerizzata (MicroCT). La microscopia elettronica a scansione e l’analisi della porosità hanno indicato che gli scaffolds realizzati con alginato di calcio (rapporto w/w rispetto al polimero 200/100) (PCL-AT2) presentano indici morfometrici (porosità, interconnessione, distribuzione e dimensione pori) molto simili a quella dell’osso trabecolare naturale come anche PCL-AT2 con l’aggiunta di idrossiaptite (PCL-AT2-HA) o polvere d’osso (PCL-AT2-BP). In parallelo l’analisi (MicroCT) ha confermato che gli scaffolds preparati con i fili d’alginato di calcio presentano spazi vuoti interconnessi tra loro, che permettono la formazione di un ambiente biologico adatto all’adesione, crescita e differenziamento cellulare. Inoltre le prove meccaniche hanno evidenziato che tutte le matrici hanno una massima deformazione attorno ai 3 Kg. La bassa resistenza al carico in tutte le matrici, rispetto all’osso naturale, è riconducibile alla scarsa presenza della componente minerale (idrossiapatite) la quale permette di avere un materiale più resistente. Le matrici PCL-WP, PCL-AT2 presentano un ricovero elastico abbastanza elevato, mentre si è riscontrato un valore basso per PCL-AT2-HA, PCL-AT2-BP, questo perché HA e BP rendono il polimero più rigido e meno elastico, cioè più simile all’osso naturale. Il saggio di vitalità (MTS Assay) eseguito su due tipologie cellulari (MC3T3-E1 e cellule mesenchimali staminali da midollo osseo di coniglio) mostra che tutti e tre i tipi di scaffolds, sopra indicati, presentano un microambiente adatto alla crescita cellulare rispetto al polimero senza l’aggiunta di porogeno PCL-WP da noi usato come riferimento. Infatti PCL-WP presenta una porosità di circa 21% mentre gli altri tra 72%-85%. Questo dato indica come una maggiore porosità influenzi positivamente l’adesione e la crescita cellulare in quanto garantisce migliore trasporto di nutrienti e di ossigeno. Inoltre avendo uno scaffold poroso, questo permette la migrazione delle cellule anche all’interno dello scaffold, colonizzando completamente la matrice, cosa non permessa dalla matrice PCL-WP in quanto più compatto. L’analisi al microscopio a scansione ha evidenziato come le cellule dopo appena 24 h dalla semina siano completamente adese alla matrice e presentano una tipica forma allungata. A tempi più lunghi, 7-14 giorni si nota che le popolazioni cellulari hanno realizzato un monostrato completo, con difficoltà nel evidenziare i contorni cellulari di una singola cellula e con un inizio di deposito di matrice extracellulare. I saggi per la valutazione dell’attività osteogenica in cellule MC3T3-E1 ha evidenziato come nei polimeri PCL-AT2-HA e PCL-AT2-BP ci sia una maggiore espressione di fosfatasi alcalina e una maggiore calcificazione della matrice rispetto a PCL-WP e PCL-AT2 questo dato significa che la presenza di fattori come idrossiapatite e polvere d’osso creano delle condizioni maggiormente favorevoli alle popolazioni celllulari affinché esse si differenzino in cellule dell’osso. L’analisi di RT-PCR eseguita su cellule MSC seminate su PCL ha confermato l’avvenuto differenziamento in senso osteogenico, in quanto è stato osservato l’espressione di marcatori tipici come osteocalcina, RUNX-2, osteopontina, collagene I. In aggiunta anche in MSC si è riscontrato un profilo simile per quanto riguarda la produzione di fosfatasi alcalina e depositi di sali calcio, dove però si è osservato che le cellule MSC su PCL-AT2-HA mantenute in condizioni basali di coltura esprimano un significativa differenza (p<0,05) nella produzione di calcio rispetto a quelle seminate sugli altri scaffolds. dato è confermato anche a 14 e 21 giorni. In conclusione possiamo dire di avere individuato un polimero adatto per la realizzazione di uno scaffold per la rigenerazione ossea, e individuato una metodica riproducibile, facile da eseguire ed economica, ottenendo scaffolds con indici morfometrici simili all’osso trabecolare naturale con utilizzo di alginato di calcio come porogeno, e capace di permettere l’adesione, la proliferazione e il differenziamento di preosteoblasti di linea e cellule mesenchimali staminali. L’aggiunta di HA e polvere d’osso agli scaffolds polimerici, non influisce sulla porosità ma garantisce maggiore rigidità, inoltre ottimizzano la potenzialità osteogenica delle matrici. Grazie alle caratteristiche della metodica di produzione, è stato possibile realizzare scaffolds con una forma di falange umana dimostrando che il metodo permette la possibilità di creare una protesi ossea su misura.